藏猪兴奋性氨基酸转运载体EAAC1基因的克隆与原核表达.doc

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1、农业现代化研究第 32 卷农业现代化研究第 32 卷第 6 期Vol32 No6 2011 年 11 月RESEARCH OF AGRICULTURAL MODERNIZATION Nov 2011 藏猪兴奋性氨基酸转运载体 EAAC1 基因的克隆与原核表达傅德智 1, 2，孔祥峰 1，杨焕胜 1, 2，褚武英 1, 3，李铁军 1，印遇龙（1. 中国科学院亚热带农业生态研究所，亚热带农业生态过程重点实验室/湖南省畜禽健康养殖工程技术研究中心， 湖南 长沙 410125；2. 中国科学院研究生院，北京 100049；3. 长沙大学生物工程与环境科学系，湖南 长沙 410003）摘 要：兴奋性氨

2、基酸转运载体 EAAC1 是肠道内谷氨酸的主要载体。本研究根据人的基因编码区设计一对特异性引物，以藏猪空 肠总 RNA 为模板，通过 RT-PCR 获得一长约 1600 bp 的 cDNA 片段，T/A 克隆后测序，并进行序列分析；将该基因片段连接到原 核表达载体 pET-32a（+）中构建融合表达质粒，转化到 E. coli BL21（DE3）中进行表达。测序结果显示，获得的 cDNA 全长为1575 bp，编码 524 个氨基酸；EAAC1 分子量为 57 kD，等电点为 5.34，GenBank 登录号为 GQ375513；该蛋白质具有 3 个 N-糖基 化位点、8 个蛋白激酶 C 磷酸

3、化位点和 1 个 cAMP/cGMP 依赖性蛋白激酶磷酸化位点，含有 7 个跨膜结构域和一个信号肽序列； SDS-PAGE 电泳检测结果表明，表达蛋白质与预期蛋白质大小一致。上述结果为进一步研究 EAAC1 的功能及其调控奠定了基础。 关键词：藏猪；兴奋性氨基酸转运载体；序列分析；原核表达中图分类号：Q781，Q786文献标识码：A文章编号：1000-0275(2011)06-0756-05Gene Cloning and Prokaryotic Expressing of Excitatory Amino Acid Carrier 1 in Tibetan PigFU De-zhi1,2,

4、KONG Xiang-feng1, YANG Huan-sheng1,2, CHU Wu-ying1,3, LI Tie-jun1, YIN Yu-long1 (1. Key Laboratory for Agro-ecological Processes in Subtropical Region/Hunan Engineering and Research Center of Animal and Poultry Science, Institute of Subtropical Agriculture, the Chinese Academy of Sciences, Changsha,

5、 Hunan410125, China; 2. Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3. Department ofBiotechnology and Environmental Science, Changsha University, Changsha, Hunan 410003, China)Abstract：Excitatory amino acid carrier 1 (EAAC1) is the major transporter of glutamate in the

6、 intestine. A cDNAfragment about 1600 bp was amplified from the total RNA of jejunum in Tibetan piglets by RT-PCR with a pair of specific primers based on the sequences of human. The recombinant vector was constructed by inserting the cDNA fragment into the prokaryotic expression vector pET-32a （）an

7、d then transformed into E. coli BL21 (DE3). Sequenceanalysis showed that the ORF of EAAC1 cDNA in Tibetan piglets was 1575 bp in length encoding 524 amino acid residues with a molecular mass of 57 kD and isoionic point of 5.34. Its GenBank accession number is GQ375513. Three putative extracellular N

8、-glycosylation sites, eight potential protein kinase C phosphorylation sites and one deduced cAMP/cGMP-dependent protein kinase phosphorylation site were identified. Seven proposed transmembrane domains and a N-terminus signal peptide were presented in EAAC1 sequence. The SDS-PAGE displayed that the

9、 expressed protein was consistent with the size of expected protein. These findings maybe provide some scientific basis for the study on function and regulation of EAAC1 in pigs.Key words：Tibetan pig; excitatory amino acid carrier 1; sequence analysis; prokaryotic expression蛋白质在小肠内被消化为小肽和游离氨基酸，并由肠道上

10、皮细胞刷状缘膜和基底膜上存在的大量转运载体介导，被 肠壁细胞吸收参与体内代谢1。游离氨基酸和小肽的跨膜转 运在蛋白质消化吸收过程中是相当关键的步骤。仔猪摄入的 日粮谷氨酸 50以上在肠道中被完全氧化生成 CO2，其产量 高于消化道葡萄糖氧化产生的 CO2 数量2, 3。肠道中的酸性氨 基酸（包括谷氨酸和天冬氨酸）不仅主要用于氧化供能，也是合 成谷胱甘肽、精氨酸和脯氨酸等生物活性分子的重要前体4, 5。兴 奋性氨基酸转运载体 EAAC1 是肠道内酸性氨基酸的主要载 体。Kanai 和 Hediger 通过原位杂交对小肠中 EAAC1 进行研 究，发现 EAAC1 仅表达在肠上皮细胞；同时，EAA

11、C1 也在肾 脏中表达，推测其很可能参与酸性氨基酸的重吸收过程6。对 EAAC1 基因的克隆、测序及原核表达研究，有助于在分子水 平上开展肠道上皮细胞酸性氨基酸转运机制与调控技术研究，对提高动物蛋白质利用效率和生产性能、降低氮排放具有重大实践价值。藏猪是我国著名的小型地方猪种，具有体 型小、基因纯合、抗逆性强等特点7，与其他动物模型相比，其 解剖、生理和代谢特点更类似于人类，可作为研究人类肠道 发育和营养物质吸收的理想动物模型 8。关于藏猪 EAAC1 cDNA 的克隆至今尚未见报道，为此，本研究以藏猪为试验材 料，设计扩增 EAAC1 基因的引物进行克隆和序列分析，并通 过原核表达获得 EA

12、AC1 蛋白质，为进一步探讨酸性氨基酸 吸收转运的分子机制奠定基础。1 材料与方法1.1 样品采集试验动物为 28 日龄纯种藏猪，购于南方医科大学实验 动物中心。通过注射过量 10%戊巴比妥钠溶液处死仔猪，快基金项目：国家自然科学基金项目 （编号：31110103909、30928018、30901040、31001016）；中国科学院知识创新工程重要方向项目 （编号：KZCX2-EW-412）。作者简介：傅德智（1986-），男，硕士研究生，主要从事分子营养学研究。通讯作者：印遇龙（1956-），男，研究员，主要从事动物生态营养与分子 生物学研究。收稿日期：2011- 05- 05，修回日期

13、：2011- 09- 28速取出空肠，置于 1.5 ml 指型管中液氮速冻，转入 - 70 保存备用。1.2 RNA 提取和 cDNA 合成利用 Trizol 试剂（Invitrogen，USA）提取空肠总 RNA，操作 步骤严格按照试剂盒说明书进行。紫外比色法测定总 RNA的 浓度，1% 琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 质量。 利用 DNAse I（Fermentas，USA） 处理 RNA 样品，除去可能残留的基因组DNA；利用逆转录试剂盒（Fermentas，USA），合成第一链 cDNA。1.3 EAAC1 的克隆根据人的 EAAC1 基因序列，用软件 Primer 5.0 设计藏猪 EA

14、AC1 基因的特异引物。上游引物为 5- ATGGGGAAACC GGCGAGGA- 3；下游引物为 5- CTAGAACTGGGAGGTCTGG GTG A- 3。藏猪 EAAC1 片段的预期长度为 1575 bp。PCR 的 扩增条件为：94 预变性 5 min；94 变性 30 s，52 退火45 s，72 延伸 2 min，共 30 个循环；最后 72 延伸 10 min。 PCR 产物用 2%琼脂糖凝胶在 TBE 电泳缓冲液中分离。将纯 化的 PCR 产物连接到 pGEM- T 载体 （Promega，USA） 上，用 EcoR酶切筛选阳性克隆，送上海英潍捷基有限公司测序。1.4 重

15、组表达质粒的构建及鉴定根据克隆的核苷酸序列设计含特定酶切位点（EcoRI/ XhoI）的 引 物 ，上 游 引 物 为 5- CGGAATTCATGGGGAAA CCGGCGAGGA- 3，下 游 引 物 为 5- CCGCTCGAGCTAGAA CTGGGAGGTCTGGGTG- 3，在上、下游引物的 5端分别加入 EcoRI 和 XhoI 酶切位点及保护碱基 （下划线部分为酶切位 点，斜体部分为保护碱基）。纯化 PCR 产物和 pET- 32a(+)载体（Merk，德国） 用 EcoRI 和 XhoI 酶切进行亚克隆。重组质粒pET32a- EAAC1 经酶切验证，送上海英潍捷基有限公司测

16、序。1.5 重组蛋白质的表达与纯化将重组质粒 pET32a- EAAC1 和空载质粒 pET- 32a（+）分 别转化表达菌株 BL21（DE3）感受态细胞，挑取抗性单菌落接 种于 3 ml 液体 LB 培养基中 （含 100 g/ml 卡那霉素）37 振荡培养过夜。次日以 1：100 的比例转接到新的液体 LB 培 养基中 （含 100 g/ml 卡那霉素）37振荡培养至 OD6000.6 时，加 IPTG（终浓度为 1 mmol/L）分别诱导 0h、1h、2h、4h 和 6 h，其间离心收集菌体，用 100 l SDS 凝胶加样缓冲液 重悬，混匀后沸水浴 5 min，12 000 转离心

17、1 min，取 20 l 上 清液于 12%的 SDS- PAGE 电泳检测。将诱导 6 h 后收集的菌体用 50 mmol/L 的磷酸钠缓冲液 重悬细胞。加入 5 mg 溶菌酶，室温下消化 0.5 h，超声破碎 30 次。去除细胞碎片，用 Hi- Trap 镍亲和柱 （北京康为） 纯化 EAAC1 蛋白质。以牛血清白蛋白为标准品，用 Bradford 法进 行蛋白质定量。12%丙烯酰胺进行 SDS- PAGE，分析纯化后的 蛋白质。1.6 生物信息学分析利 用 MotifScan 软 件（http:/myhits.isb- sib.ch/cgi- bin/ motifscan）分析 EAAC

18、1 开放阅读框（ORF），推导氨基酸序列， 预测蛋白质分子量和等电点；利用 SignalP 3.0 Server（http:/www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测信号肽；利用 Clustal W 软件进行序列间同源性比对；利用 PIR（http:/pir.georgetown. edu/pirwww/search/pattern.shtml） 预测蛋白质细胞外 N- 糖基化位点、蛋白激酶 C 磷酸化位点、cAMP/cGMP 依赖性蛋白激酶磷酸化位点；利用 ProP 1.0 Server（http:/www.cbs.dtu.dk/ services/ProP/

19、） 预测信号肽位点；利用 TMHMM（http:/www. cbs.dtu. dk/services/TMHMM- 2.0/）预测蛋白质跨膜结构域；利 用 Phyre（http:/www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre/index.cgi）预测蛋白 质 三 级 结 构 ；利 用 Protscale（http:/www.expasy.ch/tools/ protscale. html）分析蛋白质疏水性。2 结果与分析2.1 藏猪 EAAC1 基因全长 cDNA 的克隆以藏猪空肠 cDNA 为模板进行 RT- PCR，扩增出单一的 PCR 条带（图 1A），与预期大小一致。将该片段切

20、胶回收并连 接到 pGEM- T 载体上，蓝白斑筛选后，提取质粒进行酶切鉴 定，结果表明该片段已成功连接至载体上（图 1B）。将成功连 接的 pGEM- T 载体进行目的序列的测序，结果表明该片段含 有一个长为 1575 bp 的 ORF，并将该基因序列在 GenBank 上 注册（登录号为 GQ375513）。该基因编码 524 个氨基酸，分子 量为 57.2 kD，等电点为 5.34。通过 GenBank 信息查询和比 对，结果表明，该序列与其他物种的 EAAC1 基因具有很高的同源性，如与普通猪、人和小鼠的同源性分别为 99.87%、90.27% 和 84.44% ，且该序列编码的 肽链

21、和其他物种的 EAAC1 蛋白质具有高度的保守性，说明该片段为藏猪的EAAC1 基因。M12M 34bpbp450030001200200015001000AB图 1RT- P CR 扩增 EAAC1 基因（A）和pGEM- EAAC1 酶切鉴定（B）注 ：M：DNA marker；1，2：RT- PCR 扩 增 产 物 ；3：pGEM- EAAC1 酶 切 ；4：pGEM- EAAC1 未酶切。2.2 藏猪 EAAC1 基因的序列分析为了获得藏猪 EAAC1 的结构和可能的功能信息，对该 基因进行了深入的生物信息学分析。通过 PIR 预测，在藏猪 EAAC1 中存在 3 个 N- 糖基化位点

22、、8 个蛋白激酶 C 磷酸化位点和 1 个 cAMP/cGMP 依赖性蛋白激酶磷酸化位点（图 2）。信号肽分析和剪切位点分析表明，EAAC1 的 N 末端存在一个长 31 个氨基酸的信号肽序列，其剪切位点位于 Glu31 和 Ile32 之间，且信号肽序列在猪、牛、人、小鼠及大鼠中具有高度 的保守性。利用 MotifScan 和 PIR 进行结构域分析发现，其具 有两个钠 / 二羧酸同向转运载体家族的信号序列以及 7 个潜 在跨膜结构域，其中猪、牛、人、小鼠及大鼠具有相同的钠 / 二 羧酸同向转运载体家族的信号序列，说明其在结构上具有高 度的保守性（图 3）。运用 Protscale 进行疏水

23、性分析，结果表 明，藏猪 EAAC1 含有多个疏水性强的区域，具有明显的跨膜 趋势，这些疏水性强的区域和潜在的跨膜结构域在氨基酸序 758 农业现代化研究第 32 卷列上具有很好的一致性（图 4）。通过 TMHMM 2.0 在线分析发现，藏猪 EAAC1 含有 8 个潜在跨膜结构和 1 个信号肽序列， 跨膜结构和信号肽序列与上述预测的基本一致，进一步验证了跨膜结构和信号肽的存在。在 EAAC1 成熟之前，信号肽被剪去，故成熟的 EAAC1 肽链含有 7 个跨膜结构域（图 5）。图 2 EAAC1 基因 cDNA 核苷酸序列及推导的氨基酸序列注：* 代表终止子；方框代表 N- 糖基化位点；灰色代

24、表蛋白激酶 C 磷酸化位点；下划线代表 cAMP/cGMP 依赖性蛋白激酶磷酸化位点。图 3EAAC1 氨基酸序列比对注：pEAAC1、cEAAC1、hEAAC1、mEAAC1 和 rEAAC1 分别代表藏猪、牛、人、小鼠和大鼠的 EAAC1；TM1- TM7 代表跨膜结构域；方框代表信号肽序列；灰色代 表钠 / 二羧酸同向转运载体家族信号序列。Hohob./Eisenberg et al.M12M 341.00.80.60.40.20.0- 0.2- 0.4bpbp8000600020001500100020001500AB0100 200 300 400 500 600Amino acid

25、 positionEAAC1 蛋白质疏水性分析图 6 P CR 扩增（A）和 pET32a - EAAC1 双酶切鉴定（B）注：M：DNA marker；1，2：PCR 扩增产物；3：pET32a- EAAC1 未酶切；4：pET32a- EAAC1 酶切。图 41.0约 57 kD 的蛋白质，而空白对照 pET32a（+）质粒表达的蛋白质中没有此条带，且随着诱导时间的延长，该蛋白质的表达 量逐渐增加，诱导 6 h 后该蛋白质的表达量最高。镍亲和柱一 步法纯化该特异表达的蛋白质，SDS- PAGE 电泳检验其纯 度，57 kD 附近出现特异性条带（图 7），分子量与软件计算的 结果一致，说明转

26、化的大肠杆菌特异性表达了目的蛋白质 EAAC1。0.80.60.40.20.00100200300inside400outside500transmembraneM 1234567KD116图 5EAAC1 氨基酸跨膜分析6645352518.457KD2.3 原核表达质粒的构建及鉴定以稀释的测序质粒 pGEM- EAAC1 为模板，扩增到 1 条 约 1600 bp 的片段，与设计结果相符合（图 6A）。PCR 纯化产 物经 EcoR I 和 Xho I 双酶切回收后，定向连接到 EcoR I 和 Xho I 双 酶 切 的 pET32a (+) 载体上，获得 重 组 质 粒 pET32a-

27、 EAAC1。 用 EcoR I 和 Xho I 双酶切重组质粒 pET32a- EAAC1 可切出 1600 bp 左右的片段（图 6B），表明扩 增的 EAAC1 片段已插入到载体质粒中。为了进一步证明重 组质粒的构建是否正确，在酶切鉴定基础上，对重组表达质 粒 pET32a- EAAC1 进行了序列测定。测序结果表明，连入表 达载体 pET- 32a(+)中的基因片段与目的序列一致，并且酶切 位点连接处序列也正确，未出现碱基突变及移码现象，说明 已获得了正确的 EAAC1 的原核表达重组质粒。2.4 EAAC1 基因的原核表达与 S DS - P AGE 分析将重组质粒 pET32a-

28、EAAC1 转入到大肠杆菌 BL21 后， 用 IPTG 诱导其表达。结果发现，重组质粒能够特异表达一条图 7 pET32a - EAAC1 表达产物 S DS - P AGE 分析注：M：蛋白质 marker；1- 5：转化 pET32a- EAAC1 经 IPTG 诱导 0h、1h、2h、4h 和 6 h 的总蛋白质；6：转化 pET32a （+） 空载体的总蛋白质；7：纯化后的EAAC1 蛋白质。3 结论与讨论3.1 结论成功克隆了藏猪空肠 EAAC1 cDNA 的编码区，其 cDNA 全长为 1575 bp，编码 524 个氨基酸，分子量为 57 kD，等电点 为 5.34；EAAC1

29、 蛋白质具有 3 个 N- 糖基化位点、8 个蛋白激 酶 C 磷酸化位点和 1 个 cAMP/cGMP 依赖性蛋白激酶磷酸化 位点，具有 7 个跨膜结构和 1 个信号肽；在大肠杆菌中成功 表达了 EAAC1，获得了融合蛋白质。这为进一步研究藏猪ProbabilityHydrophobicity 760 农业现代化研究第 32 卷EAAC1 的组织分布、发育性表达规律、功能特性以及调控奠定了基础。3.2 讨论动物的蛋白质（氨基酸）营养及动物对蛋白质的高效利 用一直是动物营养研究关注的热点和难点问题。随着人和鼠 的氨基酸转运载体 cDNA 被克隆9，大量关于氨基酸转运载 体转运特性的研究得以开展，

30、并陆续在分子水平上揭示了氨 基酸的吸收与转运机理。近年来，关于酸性氨基酸转运载体 的研究取得了重要进展。目前，在人上已经克隆出了 5 种蛋 白质亚型的酸性氨基酸转运载体，并分别命名为 EAAT1 / GLAST、EAAT2/GLT1、EAAT3/EAAC1、EAAT4 和 EAAT510，它 们在转运谷氨酸过程中均具有立体异构性11。这些转运蛋白 可调节神经末梢谷氨酸的重摄取12，其中 EAAC1 是神经末梢 中主要的神经性谷氨酸转运蛋白13。EAAT 是钠离子共转运 载体，在转运酸性氨基酸过程中同时需要偶联钾离子的反向 转运，以维持膜两侧的钠离子梯度14。酸性氨基酸转运系统广 泛存在于动物机

31、体中。例如，GLAST 和 GLT- 1 存在于神经胶 质细胞中，而 EAAC1 则存在于神经元上15；GLAST 主要在小 脑表达，心脏、骨骼肌、胎盘和肺中也有表达16。本研究克隆的藏猪 EAAC1 cDNA 编码区，长度为 1575 bp，编码 524 个氨基酸，与人和牛有相同的氨基酸数目，比小 鼠和大鼠多 1 个氨基酸17, 18。MotifScan 和 PIR 分析表明，藏猪 EAAC1 含有 2 个钠 / 二羧酸同向转运载体家族的信号序列， 属于钠 / 二羧酸同向转运载体家族。该家族成员一般含有710 个跨膜结构域19。从大鼠和人的 EAAT1 末端拓扑结构 的研究来看，C 末端一侧

32、有 4 个跨膜区域，在 8、9 两个区域 为 2 个单环，形成一个 V 字形结构，并有一个结合位点，第 7 和第 10 疏水区域存在底物识别位点，易位区域位于第 7 跨 膜区上的 TYR403 作为钾离子结合位点，在氨基酸转运过程 中起着重要作用20。TMHMM2.0 预测发现，藏猪含有 7 个跨膜 结构域，与人和牛数目一样，但比小鼠和大鼠少 1 个跨膜结 构域21。谷氨酸转运载体的功能可以通过磷酸化和糖基化来 调控，所有的谷氨酸转运载体都含有 12 个进化上保守的 糖基化位点。本研究分析表明，藏猪的 EAAC1 含有 8 个 N- 糖基化位点，包括两个保守位点22。蛋白激酶 C 和 cAMP

33、/ cGMP 依赖性蛋白激酶也参与谷氨酸转移载体的调控，在藏 猪 EAAC1 上也发现了相对应的潜在磷酸化位点23。本研究利 用构建的原核表达载体 pET32a- EAAC1，在大肠杆菌 BL21（DE3）中表达了含 His- tag 的重组蛋白质。pET32a（+）载体中 含有的组氨酸标记物序列编码的组氨酸标记比通常所用的标 记物相对分子量小、免疫性低、亲和性好，便于分离与纯化。参考文献：G1208- G1217.Reeds PJ, Burrin DG, Stoll B, et al. Intestinal glutamate metabolismJ. J Nutr, 2000(9): S7

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