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1、腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目 录第一章 简介 1第二章 应用重组腺病毒的优点 2第三章 AdEasyTM 技术 33.1 技术概况 33.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3第四章 主要流程 44.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 4 4.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体 54.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生 5 4.2.1 共转化的一般原则 5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果 54.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 64.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A细胞 6 4.4.
2、1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术 7第五章 常用技术 85.1 QBI-293A细胞培养 8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养 8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖 8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存 85.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生 9 5.2.1 感染QBI-293A细胞 9 5.2.2 病毒空斑形成 9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 95.3 MOI测定 105.4 腺病毒感染力测定 10 5.4.1 X-Gal染色 115.5 重组腺病毒的筛选和纯化 11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送 11 5.5
3、.2 病毒空斑挑选和小量扩增 12 5.5.3 Western杂交 13 5.5.4 Southern杂交和点杂交 13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定 14 5.5.7 功能测定 145.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增 155.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 16 5.7.1 不连续密度梯度离心 17 5.7.2 连续密度梯度离心 17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集 175.8 病毒滴度测定 18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法 20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法 20第六章 疑难
4、解答 226.1 QBI-293A细胞培养 226.2 感染力测定 226.3 转移载体克隆 236.4 在BJ5183细胞中共转化和重组 246.5 转染QBI-293A细胞 256.6 筛选和测定 256.7 在QBI-293A细胞中表达 266.8 重组腺病毒的扩增 266.9 纯化 266.10 病毒滴度测定 27缩写 英文全称 中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素-Gal -Galactosidase -半乳糖苷酶bp
5、Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNAcccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNACPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbeccos Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Aci
6、d 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger
7、RNA 信使RNAMWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tr
8、is Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷第一章 简 介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基
9、因输送工具。人类基因组计划和正不断发展的基因治疗同样急需发展快速有效和治疗性的分析工具。为解决这一问题，基因输送技术(通常使用病毒载体如增殖缺陷的腺病毒)通过基因工程不断发展，致力于生产基因表型药物。重组腺病毒提供了一类在基因转移系统发展中有极大潜力的新的生物治疗剂。1953年对普通感冒病因的探索和研究导致了腺病毒的发现。迄今为止已发现了40多种不同血清型和93种不同种类的腺病毒，它们通常感染眼、呼吸道或胃肠上皮（Fields等，1996）。1977年，Frank Graham博士建立了一种细胞株，可在无辅助病毒的情况下产生重组腺病毒（Graham等，1977）。此后，腺病毒载体作为极具潜力的
10、哺乳动物基因转移载体而得到广泛应用，尤其是在基因治疗相关领域。迄今为止已有大量关于腺病毒及其应用的综述发表，我们给感兴趣的读者推荐以下文章：Hitt et al，1999和Wivelet al，1999。腺病毒亦可被用来在人体细胞中过量表达蛋白（Massie et al，1998 A, B）。但迄今为止还只有熟知腺病毒的研究人员才会采用腺病毒系统。昆腾生物科技公司是第一个提供完备而且能广泛应用的重组腺病毒试剂盒Adeno-QuestTM系统及其相关产品和客户服务的公司，这个系统的基础是在293细胞中产生重组腺病毒。现在介绍的AdEasyTM系统以细菌内重组取代哺乳动物细胞（He et al，1
11、998），使获得重组腺病毒对任何有细胞培养设备的分子生物实验室都更方便。重组腺病毒事实上可在任何细胞或组织中用来研究表达重组蛋白。AdEasyTM转移载体可允许插入7.5kb的外源DNA，目前正研究腺病毒其它区的缺失以提高腺病毒在基因治疗中的应用。这本手册提供了重组腺病毒技术中所有必须遵循的原则，并详细描述了产生一个重组腺病毒的所有实验步骤，包括重组腺病毒在QBI-293A细胞中扩增并纯化到1012VP的操作步骤。AdEasyTM载体系统包含了生产5型重组腺病毒所需的全部试剂，所有成分购买后即可使用。第二章 应用重组腺病毒的优点1. 宿主范围广, 对人致病性低这套腺病毒载体系统可广泛用于人类及
12、非人类蛋白的表达。腺病毒可感染一系列哺乳动物细胞，因此在大多哺乳动物细胞和组织中均可用来表达重组蛋白。2. 在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因逆转录病毒只能感染增殖性细胞，因此DNA转染不能在非增殖细胞中进行，而必须使细胞处于持续培养状态。腺病毒则能感染几乎所有的细胞类型，除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞。腺病毒是研究原代非增殖细胞基因表达的最佳系统，它可以使转化细胞和原代细胞中得到的结果直接进行对比。3. 能有效进行增殖，滴度高这套腺病毒系统可产生1010到1011VP/ml，浓缩后可达1013VP/ml，这一特点使它非常适用于基因治疗。4. 无需辅助病毒，可容纳7.5 kb外源DNA为提供
13、克隆空间，此腺病毒缺失了E1和E3早期区。此外，此腺病毒可包装比正常病毒DNA稍大的DNA分子（105%）。这些特点允许插入腺病毒的基因或多基因表达盒可达7.5kb。5. 与人类基因同源该腺病毒载体系统应用了人类病毒作为载体，以人类细胞作为宿主，因此为人类蛋白进行准确的翻译后加工和适当的折叠提供了一个理想的环境。大多数人类蛋白都可达到高水平表达并且具有完全的功能。6. 不整合到染色体中，无插入致突变性逆转录病毒可随机整合到宿主染色体，导致基因失活或激活癌基因。而腺病毒则除了卵细胞以外几乎在所有已知细胞中都不整合到染色体中，因此不会干扰其它的宿主基因。在卵细胞中整合单拷贝病毒则是产生具有特定特征
14、的转基因动物的一个较好的系统。7. 能在悬浮培养液中扩增293细胞可以适应悬浮培养，这一调整可使病毒大量扩增。大量事实证明悬浮293细胞可在120L的生物反应器中表达重组蛋白。8. 能同时表达多个基因这是第一个可以在同一细胞株或组织中用来设计表达多个基因的表达系统。最简单的方法是将含有两个基因的双表达盒插入腺病毒转移载体中，或者用不同的重组病毒共转染目的细胞株来分别表达一个蛋白。测定不同重组病毒的MOI比值可正确估计各重组蛋白的相对共表达情况。第三章 AdEasyTM技术3.1 技术概览AdEasyTM系统是由T.C.He等（1998）构建的用来代替传统腺病毒重组系统的一个快捷系统。在这个系统
15、中，只需二步即可产生重组腺病毒：先将表达盒装入转移载体，然后再通过同源重组插入腺病毒基因组。将外源基因插入腺病毒的最有效途径是通过同源重组，原因是：1）腺病毒DNA是大型的线性分子，含有几乎所有的内切酶切位点；2）基因组过大（36kb），难于操作。在AdEasyTM载体系统中，含有大部分腺病毒基因组的载体为超螺旋质粒，而不是线性DNA，同源重组则在大肠杆菌进行。相对于传统系统而言，这二点改进使病毒DNA操作更容易，同时由于利用了大肠杆菌的高效率同源重组特性而使重组载体的筛选更为简单。在本系统中，首先将基因cDNA插入一个转移载体，将得到的质粒用PmeI线性化，然后在大肠杆菌BJ5183中与病毒
16、DNA质粒pAdEasy-1进行同源重组。pAdEasy-1缺失了E1和E3区，其E1区功能将在293A细胞中得到互补。重组子通过卡那霉素筛选，用内切酶进行鉴定分析。最后将得到的重组腺病毒用PmeI线性化，暴露其反向末端重复序列（ITR，Iaverted Termined Repeats），转染QBI-293A细胞后产生重组病毒颗粒。同源重组在线性化的转移载体和完整的超螺旋腺病毒质粒之间进行。应用完整的腺病毒质粒而不用内切酶进行线性化，对于产生重组腺病毒至关重要。转移载体中的卡那霉素抗性基因则可用来筛选重组子。由于线性化的转移载体产生卡那霉素抗性克隆的背景较低，因此此同源重组系统有较高的信噪比
17、。大肠杆菌BJ5183有recA活性，但同时缺失介导细菌重组的其它酶，具有高效的转化和重组能力。一旦重组子经确定，则可转入普通的无recA、endA活性的细菌株如DH5等进行扩增。由于缺乏recA活性，DH5不能用于腺病毒的同源重组。3.2 Ad EasyTM系统中产生重组腺病毒的时程与传统系统相比，AdEasyTM系统中筛选和纯化腺病毒所需的时间大大缩短了。克隆和筛选约需1-3周，重组后需验证重组病毒质粒是否含有目的基因。重组子在DH5中扩增后转入哺乳动物细胞293A，最后将293A细胞中产生的重组病毒颗粒进行纯化和滴定。最终得到的重组腺病毒只能在提供E1区功能的293A细胞中进行增殖。一般
18、来说，用传统方法产生重组腺病毒并不需要大量工作，每天只需1小时进行细胞传代和观察空斑形成。但由于病毒空斑形成速度慢，整个过程就需要很长时间。而AdEasyTM载体系统用大肠杆菌产生重组病毒，大大缩短了所需时间。我们强烈建议初学者用QBI-Infect阳性对照进行感染力测定（见5.2.2）。进行这些测定之前，必须先扩增QBI-293A细胞（见5.5.1）。感染力测定使你能观察到病毒增殖导致的细胞表型的改变，获知你所用细胞对腺病毒的敏感性，而病毒空斑测定可让你观察到病毒空斑的形成。第四章 主要流程4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体AdEasyTM系统中有2种转移载体可供进行重组腺病毒构建
19、：pShuttle和pShuttle-CMV，这2个载体都含有多克隆位点（MCS）供插入基因。pShuttle不含有启动子和多聚腺苷酸位点（polyA），允许插入含特定启动子和polyA位点的表达盒。pShuttle-CMV含有单拷贝CMV启动子和polyA位点供基础表达和高表达重组蛋白，你只需将目的基因插入pShuttle-CMV的多克隆位点。表1提供了各转移载体的特性。表1 AdEasyTM转移载体特性载体名称 克隆能力 启动子 polyA位点 克隆位点 线性化位点 说明pShuttle 7.5kb MCS 共转化位点PmeI（ECoRI）转染位点（PacI） 将完整的表达盒装入多克隆位点
20、（MCS）pShuttle-CMV 6.6kb CMV + MCS 共转化位点PmeI（ECoRI）转染位点（PacI） CMV启动子能在大多数哺乳动物细胞中高效表达蛋白4.1.1 克隆的一般原则AdEasyTM转移载体的特殊设计使其极易在克隆中应用，但在设计克隆策略时应考虑以下因素：1） 在BJ5183中进行共转化之前必须将转化载体线性化。确证表1中所列的线性化位点不存在于插入的基因中。注意：在pShuttle中用EcoRI线性化时，需要用RecA辅助的限制性内切酶进行酶切。如果插入基因含有所有线性化酶切位点，那么必须进行定向突变。2） 重组腺病毒质粒在转染QBI-293A细胞之前也必须用P
21、acI进行线性化。同样，插入基因中不能含有PacI位点，如果有则必须进行定向突变。3） 克隆能力是指质粒载体能够克隆并且不影响病毒增殖能力的插入基因的最大长度。各转移载体的克隆能力见表1，建议插入基因的长度最好不超过它的上限。在pShuttle和pShuttle-CMV中分别插入大于7.5kb和6.6kb的基因将大大降低整个系统的效率。尽管也可能得到重组子，但可能会发生DNA重排，生长速度也将减慢。4） 如果要插入多个表达盒，应避免以头对头方向插入相同的元件（如CMV启动子），否则同源重组时两个元件之间的部分可能会发生丢失。5） 在进行构建腺病毒之前最好测定重组蛋白的暂时性表达。这里没有提供详
22、细的操作方法，但在CMV或其它强力启动子控制下的基因很容易进行暂时性表达实验。但某些启动子控制下的蛋白表达水平在无病毒增殖时可能不足以达到检测水平。6） 载体DNA可用氯化铯溴化乙锭平衡密度梯度离心或亲和柱法进行纯化。我们不主张用小量粗制的DNA进行转化和转染实验，因为污染的DNA将大大降低菌落和空斑的形成数。4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体构建重组AdEasyTM转移载体的一般指导如下，但我们建议对于详细的克隆技术和操作方法还需参考通用的分子生物学手册。1 若cDNA含有位置正确的粘性内切酶位点，则可将它直接克隆入转移载体。如果没有，可以使用钝末端内切酶位点，也可用含合适的酶切位
23、点的引物进行PCR或连接含有酶切位点的接头使cDNA产生新的酶切位点。PCR插入酶切位点的方法较快速，但对于长cDNA则应使用连接接头，因为在扩增过程中Taq酶可能会使序列的某些位点发生突变。2 插入基因的鉴定可以用限制性内切酶分析或PCR的方法。3 转化之前用PmeI或EcoRI将转移载体重组子线性化，消化应尽可能彻底，以减少背景信号。4 琼脂糖凝胶上观察消化产物，若消化已完全，放入65 20分钟进行灭活。5 凝胶纯化线性化载体。尽管胶纯化可能会降低转化效率，但不完全消化往往产生较高的背景，从而降低重组率。将线性化质粒去磷酸化也有助于降低背景信号。6 重悬纯化的DNA，浓度至少为0.2ug/
24、ul。每个转化实验取1ug进行，包括对照。4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生4.2.1 共转染的一般原则1） 将线性化转移载体和pAdEasyTM-1 DNA共转化BJ5183必须要用高活性的感受态细胞。试剂盒中提供的细菌为电穿孔感受态，有很高的转化效率。如果不用电穿孔法进行转化，那么必须制备化学敏感性感受态细胞，并在应用之前试验其转化活性（108已足够）。2） DH5不可用于转化，因其不支持重组，它只是用来扩增重组病毒DNA。3） 本实验需要2ug线性化胶纯化的重组转移载体，共转化和对照各需1ug。4.2.2 共转化方法同时进行实验组和对照组的转化实验：实验组共转化：1ug线性化重组
25、转移载体（5ul）和1.0ul pAdEasyTM-1载体（100ug/ul）对照组转化：1ug（5ul）线性化重组转移载体1 将BJ5183感受态细胞和电穿孔杯置于冰上。将细胞分为2管，每管40ul。2 40ul感受态细胞中至多加入6ul DNA，且DNA必须溶于水，避免含有离子。3 将BJ5183转入2mm电穿孔杯，防止有气泡形成。4 按电穿孔供应商的使用说明转化BJ5183，Bio-Rad仪器一般使用的参数为：200 Ohms、25uF、2.5KV；BTX仪器则为：5 Ohms、2.5KV、C=0。5 用1mlLB重悬转化物。6 转入1550ml离心管中，37震荡培养60分钟。7 将转化
26、物铺35块 LB/Kan（50ug/ml）培养板，37培养24小时。建议分别铺100、300和600ul，以提高至少在一块板中得到可分离菌落的机率，应该得到40100个菌落。8 挑出24个最好的克隆，转入2ml LB/Kan（50ug/ml）培养液中培养1015个小时。不要储存BJ5183培养液，因有可能产生非目的重组子。尽快抽提重组AdEasyTM质粒。9 用传统碱裂解法小量制备质粒，取一半进行0.7%琼脂糖凝胶电泳，验证超螺旋质粒的大小。玻璃珠或树脂制备质粒的试剂盒应避免使用，但粘粒DNA抽提试剂盒可以用。重组质粒大小约40kb，由于它是低拷贝质粒，所以小量制备时应相应调整具体操作。4.2
27、.3 预期结果20%以上的菌落应含有大质粒（近40kb），这些是侯选重组子。与对照培养板生长的菌落进行对照即可大概估计线性化转移载体再连接所致的背景强弱。由于在此高效重组recA+细菌中重组转移载体会形成多聚体，因此背景将表现为一个梯度。4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增将侯选重组子进行酶切分析，验证其结构。比如：PacI酶切后通常得到约30kb的片段和一个3.0或4.5kb的小片段。小片段的大小因重组位置在左臂还是复制子而不同。建议同时用克隆基因的内切酶进行分析，鉴定是否含有插入基因。挑选最佳阳性重组子转入DH5中进行扩增：转化DH5只需1-5ul小量制备的重组子。这一步对于扩增时
28、保持重组DNA的结构是必需的，因为AdEasyTM这样的大质粒在recA+细菌株如BJ5183中是不稳定的，会迅速出现缺失,而在DH5中能很容易地获得大量DNA。1 将DH5感受态细胞和电穿孔杯置于冰上。2 将1-5ul DNA加入40ul DH5感受态细胞中，DNA必须用水溶，避免含有离子。3 将DH5感受态细胞转入2mm电穿孔杯，防止形成气泡。4 按照说明转化DH5：Bio-Rad仪器一般使用的参数为：200 Ohms、25uF、2.5KV；BTX仪器则为：50 Ohms、2.5KV、C=0。5 将转化混合液重悬于1ml LB中。6 转入15-50ml离心管中，37振荡培养60分钟。7 培
29、养后用LB按一定梯度稀释转化的DH5（1:10、1:100和1:1000）8 取100ul转化液铺在LB/Kan（50ug/ml）板上，37培养24小时。未用的转化液可在4保存-2周。9 每个重组子挑13个克隆转入5ml LB扩增，以备有足够量质粒。这时，用内切酶再次分析重组DNA，以确证含有插入基因，以及重组子的稳定性。10 用柱纯化试剂盒制备至少5ug高质量的重组DNA。11 取5ug质粒用PacI消化，酚/氯仿抽提一遍，乙醇沉淀后在无菌条件下溶于50ul 0.1TE溶液。具体要求参见磷酸钙技术一章中有关转染前DNA制备的内容。4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A细胞注意：培
30、养细胞前先参阅5.1章中有关QBI-293A细胞培养的内容。磷酸钙技术中的注意点：无菌在整个过程中保持所有成分的无菌是至关重要的。昆腾公司提供的试剂盒中所有成分均是无菌的，但使用者还必须保证所用其它试剂也均为无菌。DNA纯度磷酸钙转染中所用的DNA必须是高纯度的，一些DNA污染物对培养的细胞具有很强的毒性，那些成功转染的细胞往往会被污染物杀死。沉淀时间以前的资料都建议磷酸钙- DNA共沉淀颗粒在加入细胞和培养液之前至少应反应20分钟。然而与此相反，最近的研究（Jordan等，1996）显示长时间共沉淀会形成聚合沉淀块，从而降低转染效率。因此，建议共沉淀成分混合后1分钟即可将沉淀加入细胞培养板。
31、这一时间上的调整可产生小而稳定的沉淀，能更有效地被细胞摄入。4.4.1 细胞铺板每块板都用DMEM5%进行培养，这样细胞在铺板后第二天即可达到70%汇合率。由于共转染是通过细胞表面完成的，因此转染时细胞必须是分离的，而不是汇合的。1 转染前一天以7.5105 QBI-293A细胞在60mm培养皿中铺板，用DMEM5%培养，第二天的细胞数应达到1.01.5106。37 CO2孵箱中培养。CO2孵箱有助于保持合适的PH，培养皿在不进行操作时必须始终保存在CO2孵箱中。2 转染前3-4小时换成新鲜培养液，以保证在转染过程中细胞具有超常的生长力。将培养皿放回CO2孵箱中。4.4.2 磷酸钙转化技术1
32、每个转染都必须用5ug无菌的线性化重组腺病毒DNA。2 标记一个1.5ml离心管为编号1。用微量移液枪加入169ul无菌水和5ul 2M氯化钙溶液。上下吸打二次混匀，然后一滴一滴加入50ul AdV DNA溶液和26ul 2M氯化钙，再用移液枪慢慢吹打混匀。此时缓冲液的体积为250ul，含有0.25M氯化钙和5ug DNA。3 准备第2管离心管（编号2），加入250ul 2HBS缓冲液。4 用1ml移液枪吹打2号管中的溶液形成气泡，在吹打的同时逐滴加入1号管的溶液。加完后继续吹打5秒以使其完全混匀。这一步骤对于形成的共沉淀颗粒的大小至关重要，小颗粒转染效率更高，而吹打可以形成较小的颗粒。等一分
33、钟后再加入细胞培养皿内。5 在超净台内将磷酸钙-DNA共沉淀混合物逐滴加入到培养皿中，覆盖范围尽可能广。培养液稍后即会透明，十字形晃动培养皿使沉淀均匀分布。6 培养皿放入孵箱培养过夜。4小时后，沉淀颗粒在200倒置显微镜下应清晰可见，尤其在无细胞的培养皿表面。7 第二天，去除含共沉淀颗粒的培养液，用PBS制备的1mM EDTA溶液洗一次，PBS洗2次。注意：转染后细胞都十分脆弱，容易脱壁。清洗时应十分轻柔，将PBS沿培养皿壁加入，然后轻轻旋转培养皿。用移液枪反复将培养液直接加在细胞上，即可使细胞脱落，然后收集。由于这一时期细胞十分脆弱，切勿使用胰酶消化。8 将细胞分装入4个60mm培养皿（每个
34、培养皿中加5ml DMEM5%）或一块6孔板中（每孔加3ml DMEM5%），静置6小时使其贴壁。6小时后覆盖琼脂糖以供形成病毒空斑。第五章 常用技术5.1 QBI-293A细胞培养昆腾公司的293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。若细胞密度持续在70%以下，QBI-293A细胞则能连续培养34个月维持原有细胞特性。若以购买得到的293作为第一代，则30代内能得到最佳结果。一旦到了30代，最好复苏一管细胞开始新的培养。所以，我们建议你在收到细胞后应尽快建立自己的QBI-293A细胞
35、库。QBI-293A细胞在DMEM培养液中培养，该培养液还含有4.5g/L L-葡萄糖、110mg/L丙酮酸钠、2mM谷氨酰胺和胎牛血清。血清浓度为2%10%，视实验需要来调节细胞生长速度。为简化此操作说明，培养基描述为DMEM后加血清浓度（如：DMEM5%表示：含有4.5g/L L-葡萄糖、110mg/L丙酮酸钠、终浓度为2mM的谷氨酰胺和终浓度为5%的热灭活胎牛血清）。QBI-293A细胞需按标准的细胞培养规程进行操作，在健康状态时，它们呈成纤维细胞样并在培养瓶中贴壁形成单层细胞。被感染的细胞则变圆脱落，即所谓的细胞病理效应（CPE）。所有的细胞培养操作都应严格遵循无菌原则，这一点是至关重
36、要的。抗生素可用可不用，但无抗生素条件对于操作质量来说通常是一个好的对照。QBI-293A细胞生长的相对密度见下表：表2：汇合率与细胞数量汇合率(%) 60mm培养皿 100mm培养皿50 1.60106 3.510675 2.40106 5.25106100 3.20106 7.001065.1.1 QBI-293A细胞初始培养1. 将冻存的一管QBI-293A细胞在37水浴轻轻晃动融化。2. 融化后在超净台无菌条件下用70%乙醇将冻存管的盖沿擦拭干净。3. 将细胞转入15mL无菌离心管中，加入10mL DMEM 10%，600g离心5分钟使细胞沉淀。4. 弃去上清。5. 将细胞用10mL
37、DMEM 10%重悬，轻轻打匀6. 转入75cm2培养瓶或100mm培养皿中培养。7. 在5% CO2孵箱中37培养过夜。8. 第二天观察细胞汇合率，若合适则可进行实验，否则按5.1.2所述继续培养。5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖QBI-293A细胞必须按1:10到1:20传代1. 室温下胰酶消化13分钟使贴壁细胞脱落2. 拍打培养瓶边缘使细胞脱落，在倒置显微镜下观察细胞是否变圆，是否已从培养瓶表面脱落。3. 按需要用新鲜培养液稀释细胞悬液，转入新的培养瓶中。在5% FBS中，细胞倍增的时间是26小时，在10% FBS中稍短一些。5.1.3 QBI-293A细胞的冻存建立细胞
38、库时必须使培养的细胞汇合率低于50%，以保证亚克隆的特定表型。1. QBI-293A细胞必须在含10%高质量FBS的DMEM中培养。2. 将健康生长的QBI-293A细胞离心沉淀。3. 以最小体积的DMEM 10%重悬细胞。4. 用血球计数器进行细胞计数。5. 用DMEM5% + 10% DMSO + 40% FBS重悬细胞，细胞终浓度为1106/mL。6. 无菌操作将1mL细胞悬液转入2mL冻存管中。7. 将冻存管放入冻存盒中，-80储存24小时。这一简便措施可保持约1/分钟的降温速率，适于冻存细胞。8. 第二天将冻存的细胞转入液氮罐或-150冰箱中长期保存。QBI-293A细胞若正确冻存，
39、则可在液氮罐中保存数年。5.2 QBI-293A细胞的感染和病毒空斑的产生感染QBI-293A细胞和产生病毒空斑在这本手册的多种操作中都得到应用，其具体操作视不同的实验目的而稍有差异（如滴度测定、大规模扩增和纯化）。这一节提供了一个基本的操作说明，并详细描述了QBI-293A细胞感染后不同时间的具体变化。5.2.1 感染QBI-293A细胞QBI-293A细胞中腺病毒的感染周期表现为光镜下可见的细胞表型的改变，此周期始于病毒和细胞接触后。被感染细胞的表型变化与病毒接触的时间以及病毒细胞比率相关，这个比率称为感染复数（MOI）。病毒控制细胞并阻止细胞的生长需要几个小时的时间。1020的MOI值通
40、常用于需要同时感染所有细胞时，此时细胞汇合率应该在9095%左右，因为细胞在感染数小时内将停止生长。加入病毒的量可通过MOI值测定（见5.3）或病毒滴度测定（见5.8）确定。在这个MOI值条件下，被感染细胞的形态在12天后就会完全改变：细胞变圆并逐渐从壁上脱落（见5.2.2）。随着病毒的增殖，细胞核将占据细胞的大部分，这一表现称为细胞病理效应（CPE）。感染后3天，所有细胞都将呈现CPE。当QBI-293A细胞在MOI值为1或更低的情况下被感染，则只有一部分细胞能被感染。此时感染所有的细胞必须产生完整的感染周期并释放病毒，整个过程大概需要4天。在这个过程中，未被感染的细胞将继续生长，细胞可能在
41、未被全部感染时达到100%汇合率而停止生长。感染后的表现是多种多样的，但典型的表现是在感染后5天可见大多数细胞呈现CPE而其余的细胞表现为原来未被感染的形态。感染的操作很简单，只要将病毒与细胞接触。为增加感染的有效性，在最初2小时感染中最好将培养液的体积减到最小，这样病毒与细胞接触得会更紧密，然后再增加培养液。此外，缓慢而持续地晃动培养板（Mittereder et al. 1996）可使病毒分布更均匀，从而使感染效果更好。注意：处理细胞和病毒时都必须使用消毒的枪头。5.2.2 病毒空斑形成病毒空斑形成源于一个细胞被一个病毒感染后，经过多次完整的感染周期释放病毒再感染周围的细胞。病毒空斑的形成
42、是一个缓慢的过程，甚至在光镜下能观察到空斑之前，细胞已经达到100%汇合。为限制病毒的扩散，通常在培养液中加入琼脂糖，但在琼脂糖覆盖下观察细胞形态的改变则要稍微困难一些。感染后7天左右可以在显微镜下看到小的空斑，表现为一定区域内细胞呈现CPE。第10天可以在光镜下看到形态完整的空斑，有经验的研究者则能凭肉眼观察到培养板底部有小的空白斑点形成。到14天，空斑可非常容易地被挑选出来。5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞将琼脂糖覆盖细胞不是一项容易的技术，你必须在琼脂糖凝固之前迅速地将它在单层细胞上完全铺匀。但是如果铺得太快太重，那么细胞往往会脱壁。但通过几次实验后，这一步应该比较容易了。琼脂糖/DME
43、M混合物制备：1. 用无菌PBS制备5% SeaPlaque琼脂糖（FMC产品）储存液，高压消毒后每管10mL分装在50mL塑料离心管中，4保存。2. 使用之前先在微波炉中融化5% SeaPlaque琼脂糖（避免沸腾），然后冷至45。防止琼脂糖沸腾最好的办法是在沸水浴中加热，如果没有完全融化的话再在微波炉中加热数秒。3. 加入30mL预平衡至37的DMEM5% 后充分混匀，这样琼脂糖的终浓度为1.25%。立即使用。覆盖QBI-293A细胞：在进行下一步操作之前，请确认细胞是否已贴壁完好。1. 移去培养液，用1.25%琼脂糖/DMEM混合物覆盖单层细胞。2. 沿着培养板的边缘将琼脂糖轻轻加入，加
44、入的具体体积参考表3，然后放回CO2孵箱培养。表3：不同培养器皿应用的琼脂糖体积培养皿大小 首次量 追加量100 mm 10 mL 5 mL60 mm 5 mL 3 mL6孔板 3 mL 1.5 mL空斑应在1021天内形成，为保持细胞活力，每45天或培养基变黄时追加琼脂糖/DMEM混合物。5.3 MOI测定这一实验用来粗略估计病毒上清中病毒颗粒的数量（精确测定病毒颗粒数量见5.8节的滴度测定）。MOI测定通常在扩增病毒尤其是在大量扩增的时候使用，以确定感染的最佳条件。这一实验可在含有1106QBI-293A细胞/孔的6孔板中进行。1. 移去培养液，每孔加入500L新鲜的培养液2. 一孔为对照
45、，其余每孔分别加入2、5、10、25、50L病毒上清。3. 不断缓慢晃动培养板，培养约3小时。4. 加入1.5mL新鲜培养液培养72小时。观察每孔细胞是否出现CPE，根据预先的估计，感染后3天细胞完全出现CPE的病毒MOI值为1020。这样，根据感染的细胞数量，你就可以估计出上清中的病毒量。5.4 腺病毒感染力测定这一实验的目的是确定腺病毒是否能将DNA转导入293之外的某一细胞株。该实验至关重要，因为它将确定腺病毒是否可应用于这个细胞株，以及如果能应用则需要多少的病毒量（也就是需要大量扩增的程度）来完成整个研究。这个实验中，如果用的是Ad5-CMV-LacZ则检测-半乳糖苷酶，Ad5-CMV
46、-GFP或Ad5-CMV5-GFP则检测GFP。这些高滴度的产品都可单独向昆腾公司购买。本实验的阳性对照（-半乳糖苷酶检测）亦可向昆腾公司购买，但由于病毒滴度太低而不适于直接进行实验，通常需要扩增以达到理想的病毒滴度（扩增步骤见5.6）。腺病毒转导的效率各个细胞株都不太一样，其中尤以淋巴细胞株最难转导。腺病毒感染力测定通常在多孔板中进行，MOI为1200，当测定淋巴细胞株时MOI可至1000。对大多数细胞株来说，150的MOI值可将报告基因转入所有的细胞而不会出现任何的毒性。在高MOI情况下，某些病毒蛋白的高表达可对某些细胞产生毒性。无论MOI为多少，感染时都必须用最小的培养液体积并不断晃动，
47、以使感染效果达到最佳。1. 按5.2.1中所述方法在6孔板中用不同数量病毒感染细胞（合适的MOI范围），培养48小时。2. 进行X-gal染色（见下述）。注意细胞与病毒培养后不必清洗细胞，在整个实验过程中让病毒留在培养液中。5.4.1 X-gal染色1. 弃去培养液，用37预热的PBS冲洗一遍，然后加入足量固定液（戊二醛或多聚甲醛）以覆盖细胞，0.05%戊二醛室温孵育515分钟或2%多聚甲醛室温孵育60分钟。2. 弃去固定液，室温下用PBS彻底洗3遍：第一遍将冲洗液立刻弃去，第二、第三遍则让冲洗液保留5分钟。3. 加入最小体积的X-gal溶液。4. 37孵育1至12小时（过夜），阳性细胞将被染成蓝色。染色完成后可将培养板置于4保存。溶液：a） 戊二醛固定液使用前将戊二醛用PBS稀释至终浓度为0.05%。b） 多聚甲醛固定液1. 将2g多聚甲醛溶解在50mL预热至55的水中。2. 加入2滴10 N NaOH，溶液将变澄清。3. 待多聚甲醛溶解后，加入10
