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1、喉癌组织中肿瘤相关抑制基因表达与DNA甲基化的关系杨静 金明珠 季文樾 顾兆伟 赵旭东（中国医科大学附属盛京医院耳鼻喉科 110004）摘要 目的 探讨喉癌组织中MGMT、RASSF1A基因表达水平与基因DNA甲基化的关系。 方法 应用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)和实时定量逆转录聚合酶链反应(Realtime-PCR)分析50例喉癌组织中MGMT、RASSF1A基因启动子区域DNA甲基化和基因表达情况。结果 50例喉癌组织中，基因MGMT的DNA甲基化率达54%，而正常对照组无DNA甲基化，二者之间有显著差异（P0.05）。RASSF1A的DNA甲基化率达62%，而正常对照组无DNA甲基
2、化，二者之间有显著差异（P0.05）。基因mRNA表达与其启动子区DNA甲基化水平呈负相关。结论 在喉癌组织中MGMT、RASSF1A表达缺失与基因高甲基化呈正相关。喉癌抑癌基因启动子区甲基化可能是导致其基因表达下调的主要原因。关键词 喉癌 MGMT RASSF1A DNA甲基化 The relationship between tumor suppressor genes expression and DNA methylation in Laryngeal carcinoma tissuesJing Yang Ming-Zhu Jin Wen-Yue Ji Zhao-Wei Gu Xu-D
3、ong ZhaoAbstract Objective To investigate the relationship between MGMT and RASSF1A gene expression and DNA methylation in laryngeal carcinoma tissues. Methods Utilize MSP (methylation specific polymerase chain reaction) and Realtime-PCR (real-time quantitative reverse transcription polymerase chain
4、 reaction) to analyze MGMT and RASSF1A gene promoter region DNA methylation, and gene expression in laryngeal carcinoma tissue of 50 cases. Results In 50 cases of laryngeal carcinoma, DNA methylation rate of gene MGMT can achieve 54%, while the normal control group have no DNA methylation, so there
5、is a significant difference (P 0.05). DNA methylation rate of gene RASSF1A can achieve 62%, while the normal control group have no DNA methylation, so there is a significant difference (P 0.05). Gene mRNA expression has negative correlation with its promoter DNA methylation level. Conclusion There i
6、s positive correlation between the expressive deletion of MGMT and RASSF1A and gene hypermethylation in laryngeal carcinoma tissue. Laryngeal tumor suppressor gene promoter methylation maybe the main reason to induce its lower gene expression.Key words laryngeal cancer; MGMT；RASSF1A；DNA methylation;
7、 喉癌是耳鼻咽喉头颈外科常见的恶性肿瘤，约占全身恶性肿瘤的1%5%，居第11位，占头颈部恶性肿瘤的35.4%，居第三位，其中95%以上为鳞状细胞癌，近年来发病率有明显的增长趋势，仅2005年就新增病例16万，严重危害着人类健康1。我国北方是相对高发地区。尽管近30 年来喉功能保留率已经有了很大的提高, 但总的5 年生存率没有大的变化2。因此早期发现、早期治疗、寻找新的有效的治疗药物以及减少对正常组织的损害成为迫切需要解决的问题。研究发现3，生物基因组储存着遗传学和表遗传学两种信息，遗传学的信息决定着生物体细胞基因型；而表遗传学是指不涉及DNA序列改变的，可以通过细胞分裂进行传递的信息，它参与基
8、因表达调控，这种表观遗传修饰对于肿瘤的发生具有重大意义。DNA甲基化和组蛋白修饰、染色质重塑等是表观遗传修饰的主要方式。其中DNA 甲基化是导致肿瘤最常见的表遗传学事件，因而研究甲基化与肿瘤的关系成为目前肿瘤分子生物学研究的热点之一4。喉癌中许多肿瘤相关抑制基因的转录抑制与其启动子区甲基化密切相关，我们应用甲基化特异性PCR和Realtime PCR分析喉癌组织中抑癌基因MGMT及RASSF1A启动子区域甲基化和基因表达，研究了喉癌组织中两种肿瘤相关基因甲基化紊乱情况，澄清是否同一个体肿瘤中存在不同基因的高甲基化紊乱问题。1. 材料与方法1.1 材料1.1.1研究对象：选择2008年1月-20
9、09年5月中国医科大学附属盛京医院耳鼻喉科住院的喉鳞状细胞癌患者（喉癌组）50例，男44例，女6例，年龄40-74岁，平均589.76岁。取全喉切除标本距肿瘤2.0cm以上正常喉黏膜组织15例作为对照组。手术取下的新鲜标本立即浸入液氮中后置于-70冰箱保存。喉癌组按2002年UICC喉癌分期标准：其中早期（期+期）24例（T1N08例，T2N016例），声门上型13例，声门型11例。中晚期（期+期）26例（T3N08例，T4N07例，T3N14例，T4N13例，T3N23例，T3N31例），声门上型14例，声门型12例。所有喉癌组织均经病理证实为鳞癌。术前均未经放化疗治疗。标本提取均经中国医科
10、大学附属盛京医院伦理委员会批准，并签署患者知情同意书。1.1.2主要试剂及仪器：Taq DNA聚合酶（Takara公司，日本），TRIzol（Invitrogen公司，美国），MGMT、RASSF1A的 Realtime引物、甲基化和未甲基化引物，亚硫酸氢钠（Sigma公司，美国），SYBR GreenI 实时定量PCR逆转录试剂盒（日本TaKaRa 公司），DNA Marker DL-2000（TaKaRa 公司，日本），Wizard DNA clean-up systerm试剂盒（Promega公司，美国），深低温冰箱（SANYO，日本），紫外分光光度仪(岛津UV-1601，日本)，低温高
11、速离心机(eppendorf centrifuge 5810R，HITACHI，日本)，超声波仪（UP 50H，Gmbrl，德国），PCR仪（Takara公司，日本），琼脂糖凝胶电泳装置(BIO-RAD，美国)，电泳凝胶成像分析系统（Chemi Imager 5500，ALPha InnCh，美国）1.2方法1.2.1 SYBR Green I实时定量PCR检测MGMT和RASSF1A基因在各组组织中mRNA的表达：用TRIzol 试剂一步法提取喉癌组织总RNA( 按说明书进行)。按照反转录试剂盒说明将其反转录成cDNA第一链。无RNA酶的双蒸水将cDNA10倍稀释。进行荧光定量PCR扩增，由
12、PCR 反应曲线得到Ct 值，以GAPDH为内参，采用2-ct方法进行相对定量。实验重复三次，取其平均值进行统计分析。基因MGMT片段为151bp。引物为：上游引物：5- CGAAATAAAGCTCCTGGGCA -3下游引物：5- GAACTCTTCGATAGCCTCGGG -3。基因RASSF1A片段为242bp。引物为：上游引物：5- TCGTCCACGTTCGTGTCCC-3下游引物：5- AAGTTCACCTGCCACTACCGC -31.2.2 甲基化特异性PCR检测喉各组组织MGMT，RASSF1A基因启动子区DNA甲基化情况：提取喉癌组织中DNA。紫外分光光度仪定性、定量。亚硫
13、酸氢钠修饰DNA， Wizard DNA Clean-up Systerm(Promega)纯化。离心沉淀DNA。采用甲基化特异性PCR方法。MGMT甲基化片段为116bp。甲基化上游引物：5- GGTCGTTTGTACGTTCGC -3，下游引物：5- GACCGATACAAACCGAACG -3。MGMT非甲基化片段为122bp。非甲基化上游引物：5- GTAGGTTGTTTGTATGTTTGT -3，下游引物：5- AACCAATACAAACCAAACA -3。RASSF1A片段为169bp。甲基化上游引物：5- GGGTTTTGCGAGAGCGCG -3，下游引物：5- GCTAACA
14、AACGCGAACCG -3。非甲基化上游引物：5- GGTTTTGTGAGAGTGTGTTTAG -3，下游引物：5- CACTAACAAACACAAACCAAAC -3。PCR反应条件：9512 min后，95变性30 s，64退火45s，72延伸30 s，35个循环，72再延伸7 min，琼脂糖凝胶电泳，EB染色。结果经Alpha Image 2000自动成像仪成像采集数据，分析电泳结果。实验重复三次，取其平均值进行统计分析。1.3 统计学处理：应用SPSS17.0软件分析，mRNA表达水平定量测定结果用t检验，甲基化和临床病理参数的关系采用2检验（Fisher，精确概率法）。P0.05
15、。（表1）2.2 喉癌组织中基因MGMT，RASSF1A的mRNA表达本研究检测了50例喉癌和15例喉正常黏膜的MGMT和RASSF1A的mRNA水平。两种基因在对照组mRNA全部表达，喉癌组MGMT基因mRNA的ct均值为31.320.66,GAPDH基因的ct均值为22.061.85，对照组MGMT基因ct均值为30.770.35,GAPDH基因的ct均值为23.641.25，喉癌组mRNA表达量明显下调, 有统计学意义（P 0.05）。运用2-Ct法计算得出喉癌组MGMT基因mRNA表达量与对照组mRNA表达量相比，值为0.480.59,两者差异有统计学意义（P 0.05）。喉癌组RAS
16、SF1A基因mRNA的ct均值为30.740.83,对照组ct均值为30.070.34,喉癌组mRNA表达量明显下调, 有统计学意义（P 0.05）。运用2-Ct法计算得出喉癌组RASSF1A基因mRNA表达量与对照组mRNA表达量相比，值为0.620.58,两者差异有统计学意义（P 0.05）。同时，甲基化对两种基因mRNA表达的影响要高于非甲基化组（P 0.05）（表2，图3）。临床病理学参数n甲基化阳性例数PMGMTRASSF1AMGMTRASSF1A性别男4423280.5170.528女643年龄组中年组（60岁）2416160.1620.776老年组(60岁)261115临床T分级
17、T1+T22413140.9820.616T3+T4261417淋巴转移阳性11680.9680.417阴性392123分化程度高分化2918190.5860.089中低分化21912分型声门型2313160.7470.319声门上型271415表1，喉癌组织中两种基因DNA甲基化和临床病理参数的关系Table 1 The relationship of DNA methylation and clinical pathologic parameters in the two genes of laryngeal carcinoma tissues MGMTRASSF1A甲基化非甲基化甲基化非
18、甲基化n27233119mRNA相对表达量0.340.580.640.570.440.540.920.53P0.0040.001表2，启动子区甲基化对基因mRNA表达的影响Table 2 the effect of DNA methylation to gene mRNA expression3 讨 论近来，在肿瘤学研究中发现启动子区高甲基化异常是导致许多肿瘤抑制基因表达异常的内在机制，目前普遍认为DNA甲基化是除缺失与突变之外导致基因失活的第三种机制，在肿瘤的发生发展起着不可忽视的作用。越来越多的证据显示DNA甲基化是一个早期的分子事件，有可能加速肿瘤的进展5。近年来头颈部肿瘤相关基因的研究
19、集中在相关基因启动子区高甲基化，特别是抑癌基因的研究已成为热点。CpG 岛的异常甲基化会导致众多抑癌基因失活。在正常细胞中抑癌基因启动子区保持非甲基化状态，基因正常转录，表达，而在肿瘤细胞中，抑癌基因启动子区甲基化6，转录受到抑制，基因不能表达。如今，DNA甲基化是最重要的表遗传改变之一7,8，抑癌基因启动子甲基化致基因失活是肿瘤发生的重要原因之一9。DNA 异常甲基化导致肿瘤发生的可能机制如下10 ：首先，在正常情况下非甲基化的CpG岛的高甲基化，可以导致肿瘤抑制基因的失活。其次，DNA 甲基化可以促进肿瘤相关基因的突变，因为5-甲基胞嘧啶可自发或在S-腺苷蛋氨酸的作用下引起邻位脱氨而变为胸
20、腺嘧啶，使甲基化的CpG突变为TpG，这是最常见的突变，是肿瘤相关基因甲基化促进细胞恶变的一种机制。MGMT是一种高效的DNA修复酶，对保护细胞免受烷化剂损害，防止细胞癌变和死亡具有极为重要的作用。如果MGMT 异常，不能发挥正常的作用或作用不足，将导致喉癌细胞DNA中G:C 配对转换为A:T 配对，就会导致癌基因的激活和抑癌基因失活，进一步发展引起肿瘤。RASSF1A 是RAS 相关区域家族1A基因，定位于染色体3p21.3，是Dammann 11等于2000 年克隆到的新基因。Huebner认为RASSF1A基因可能是第一个重要的主要由启动子甲基化而失活的抑癌基因。目前认为可能有2种机制可
21、以解释其抑制肿瘤生长的作用: RASSF1A 蛋白通过抑制Ras激活生长效应信号的传导途径而发挥抑癌作用; RASSF1A 蛋白的失活导致Ras作用的失衡，使其主要发挥促进生长的作用12 在实验中，我们发现在喉癌组织中基因MGMT的甲基化率为54%，RASSF1A的甲基化率为62%，正常对照组二个基因均无DNA甲基化，说明喉癌的发生与抑癌基因的启动子区甲基化有关。MGMT、RASSF1A基因出现启动子甲基化的组织其mRNA表达水平明显低于出现非甲基化的组织，同时也明显低于正常对照组，从而得出喉癌组织中抑癌基因表达与CpG岛甲基化呈负相关的结论。肿瘤的病因及发病机制复杂，对肿瘤表遗传学的认识将有
22、助于更好地理解肿瘤的发生、发展机制，从而指导肿瘤的诊断、治疗和预防。虽然表观遗传治疗的研究和应用刚刚起步，但是肿瘤表观遗传治疗的有效性已在体外及动物实验中得到证实，部分临床试验也取得了令人鼓舞的结果。最近利用细胞核转移技术证实了改变受精卵的表观遗传信息会逆转肿瘤的表型13。更深入地研究DNA甲基化有望在基因表达调控和肿瘤发生上获得新的突破，并可能提出新的治疗靶点。4 参考文献1 Marioni G, Marchese-Ragona R, Cartei G, et al. Current opinion in diagnosis and treatment of laryngeal carcin
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29、aryngeal carcinoma T1: sample 1; T2: sample 2; T3: sample 3; POS: positive control, NEG: negative control, m: methylation bands u: unmethylated bandsM T1 T2 T3 mucosa m u m u m u m u POS NEG图2，喉癌组织的RASSF1A基因启动子甲基化表达T1：样本1；T2：样本2；T3：样本3；mucosa：黏膜pos：阳性对照，neg：阴性对照，m：甲基化条带，u：非甲基化条带Fig2. The methylation
30、 expression of RASSF1A gene promoter in laryngeal carcinoma T1: sample 1; T2: sample 2; T3: sample 3; POS: positive control, NEG: negative control, m: methylation bands u: unmethylated bands 图3，启动子区甲基化对基因mRNA表达的影响Fig3. The effect of DNA methylation to gene mRNA expression第一作者：杨静 女 辽宁沈阳人 博士 讲师、主治医师 研究方向：喉癌及淋巴结转移的临床和基础研究 工作单位：中国医科大学附属盛京医院 通讯地址：辽宁省沈阳市三好街36号耳鼻喉科 110004 联系电话：18940255727 邮箱：yangjing7694通讯作者：季文樾 男 辽宁抚顺人 博士 教授、主任医师研究方向：喉癌及淋巴结转移的临床和基础研究 工作单位：中国医科大学附属盛京医院 通讯地址：辽宁省沈阳市三好街36号耳鼻喉科 110004 联系电话：13898885708 邮箱：wenyueji
