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1、声 明本人声明所提交的学位论文是本人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包括为获得四川大学或其他机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所作的任何贡献均已在论文中做了明确的说明并表示谢意。本学位论文成果是本人在四川大学就读期间取得的，论文成果归四川大学所有，特此声明。 论文作者签名： 指导教师签名：儿童急性淋巴细胞白血病IKZF1基因表达研究Expression of Active and Dominant-Negative IKZF1 Transcripts in Ch
2、ildren with Acute Lymphoblastic Leukemia七年制研究生：夏 帆 导 师：高 举 教授 指 导 教 师：袁粒星 副教授目 录缩略词表.1中文摘要.5英文摘要.7前 言.材料与方法.结 果.讨 论.全文总结.参考文献.综 述.致 谢.缩 略 词 表（按字母顺序排序）缩写英文中文全称ALLacute lymphocytic leukemia急性淋巴细胞白血病BCRB-cell antigen receptorB细胞抗原受体bpbase pair碱基对CCLGChildrens Cancer and Leaukaemia Group 儿童肿瘤与白血病协作组CDcl
3、uster of differentiation分化抗体群cDNAcomplementary DNA互补DNAddH2Odouble-distilled water双蒸水DEPCdiethypyrocarbonate焦碳酸二乙酯GAPDHglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase甘油醛-3-磷酸脱氢酶GMPgranulo-monocyte progenitors粒-单核前体细胞HSChaemopoietic stem cell造血干细胞IKZF1(IK)Ikaros family zinc fingerIkaros 家族锌指LMPPlymphoid-pri
4、med multipotent progenitors有淋巴细胞倾向的多潜能前体细胞mRNAMessenger RNA信使RNAODoptical density difference吸光度差Pprobability可能性PBSPhosphate Buffered Saline磷酸盐缓冲液PCRPolymerase Chain Reaction聚合酶链式反应Ph+Philadelphia Chromosome positive费城染色体阳性RIribonuclease inhibitor核糖核酸酶抑制因子rpmrotation per minute每分钟转数TdTterminal deoxyn
5、ucleotidyl transferase末端脱氧核苷酰转移酶WBCWhite blood cells白细胞中文摘要目的 研究儿童ALL骨髓单个核细胞IKZF1(IK)基因可变剪接转录本表达情况，及其在各种临床预后因素ALL亚组的表达谱(expression pattern)，探讨其与儿童ALL发病和预后的可能关系。方法 采用巢式RT-PCR方法，检测我院儿童血液肿瘤科收治的43例ALL患儿骨髓单个核细胞和20例健康对照儿童外周血单个核细胞功能性IK和显性负IK转录本表达情况，并经DNA测序证实，统计分析不同预后因素ALL患儿IK可变剪接转录本的阳性表达率。结果 ALL患儿IK表达谱与健康对
6、照儿童IK表达谱具有明显差异。尽管两组研究对象均表达IK各种转录本(包括功能性和显性负IK转录本)，但对照组除1例外均表达功能性IK(尤其是IK2)，其表达水平明显高于显性负IK表达水平。而大多数ALL患儿表达显性负IK，约44%的ALL患儿甚至仅较高水平表达一种或多种“显性负”IK。1. ALL患儿IK2阳性表达率为51%，而对照组IK2阳性表达率为95%；ALL患儿和对照组功能性IK (IK1+IK2)阳性表达率分别为58%和95%，对照组阳性表达率均显著高于ALL组(P0.05)。2. 尽管从IK4阳性表达率而言，ALL显性负IK4阳性表达率(39.6%)显著低于对照组(90%) (P0
7、.05)。3. 标危组、中危组和高危组ALL功能性IK(IK1+IK2)阳性表达率分别为80%、67%和37.5%；标中危合并ALL组和高危ALL组功能性IK(IK1+IK2)阳性表达率分别为74%和37.5%，均具有统计学显著差异（P0.05）。单独统计分析不同临床危险度ALL间各种显性负IK阳性表达率无统计学显著性差异。4. 泼尼松敏感ALL功能性IK(IK1+IK2)阳性表达率(71%)显著高于泼尼松不敏感ALL(22%)(P0.05)，但组间单一显性负IK阳性表达率并无统计学显著性差异。5. 除显性负IK6外，初诊WBC50109/L和初诊WBC50109/L两组ALL患儿IK阳性表达
8、率无显著性差异。结论 本文在国内首次研究比较了ALL患儿骨髓单个核细胞和健康对照儿童外周血单个核细胞IK表达谱，及其与ALL各种预后因素的关系。初步研究结果显示，两组研究对象IK表达谱具有显著差异，ALL患儿功能性IK阳性表达率显著低于对照儿童，而且高危以及泼尼松不敏感ALL组功能性IK阳性表达率也显著降低，提示IK可能在儿童ALL发病中发挥着重要作用，IK异常表达（功能性IK低表达和或显性负IK高表达）可能是具有高危不良预后因素ALL的一个普遍特征。关键词 急性淋巴细胞白血病(ALL)；Ikaros家族锌指蛋白1( IKZF1)；巢式PCR；DNA测序；表达谱 (expression pat
9、tern)；儿童Expression of Active and Dominant-Negative IKZF1 Transcripts in Children with Acute Lymphoblastic LeukemiaPostgraduate: Xia Fan Tutor: Gao Ju, Prof of PediatricsABSTRACTOBJECTIVES: To determine the expression patterns of active and alternatively spliced dominant-negative Ikaros (IK) transcri
10、pts in children with acute lymphoblastic leukemia (ALL), and to explore the possible correlations between Ikaros expression and various prognostic risk factors in ALL.METHODS: The expression patterns of IK transcripts in bone marrow mononuclear cells and peripheral mononuclear cells, isolated from 4
11、3 children with ALL and 20 age-and sex-matched control children respectively, were determined by nested RT-PCR. The identities of various functional /active and dominant-negative IK transcripts were judged by their corresponding electrophoretic positions on agarose gel and further confirmed by DNA s
12、equencing. Expression positivities of every active and dominant-negative IK transcripts were compared between ALL group and control, and between ALL subgroups with different prognostic risk factors.RESULTS:1. Although both active and dominant-negative IK transcripts were expressed in mononuclear cel
13、ls from ALL and normal control children, distinct overall expression patterns were documented in the two groups. High levels of expression of active IK (especially IK2) were detected in the majority of controls, while dominant-negative IKs were expressed in most of ALL cases, with 44% of ALL express
14、ing exclusively one or more dominant-negative IK transcripts. 2. Expression of active IK transcripts was significantly lower in ALL (51% positivity for IK2, and 58% positivity for IK1+IK2) than in controls (95% positivity) (P0.05).3. In terms of positive expression of active IK transcripts (IK1+IK2)
15、, there were statistically significant differences among the three risk groups of ALL, with much lower percentage of expression positivity in high-risk ALL (37.5%) than that in standard risk (80%), medium risk (67%) or standard+medium risk (74%) ALL groups (P0.05). Nevertheless, there existed no cor
16、relations between positive expression of each dominant-negative IK transcript and ALL risk categories. 4. Similarly, the ratio of positive expressions of active IK transcripts (IK1+IK2) was significantly higher in prednisone good responder (71%) than that in prednisone poor responders (22%) (P0.05),
17、 although no such differences were identified between the two ALL risk groups in terms of expression positivity of each dominant-negative IK transcript.5. For ALL patients with initial WBC50109/L and WBC50109/L respectively, there were no significant differences of all IK transcripts except the domi
18、nant-negative IK 6 transcript. CONCLUSIONS: As to our best knowledge, this study reveals, for the first time in our country, that ALL displays distinct overall expression pattern from that in normal control children. The findings that significantly less or absent expression of active IK transcripts
19、in ALL as compared to normal control children, and that significantly less expression of active IK transcripts in some unfavorable ALL categories (specifically, high risk ALL and prednisone poor responders ), suggest that IK might play very important roles both in the regulation of lymphopoiesis and
20、 leukemogenesis. KEY WORDS: Acute lymphoblastic leukemia (ALL); Ikaros zinc finger protein 1 (IKZF1); Nested RT-PCR; DNA sequencing; Expression pattern; Children儿童急性淋巴细胞白血病IKZF1基因表达研究前 言白血病(leukemia)是儿童期最常见的恶性肿瘤，也是儿童最主要的死亡原因之一，严重危害儿童健康甚至生命，其中最常见的类型为急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)，约占75%80
21、%。 近二十三年以来，儿童ALL的预后已得到很大改观，长期无事件生存率(event-free survival, EFS)和总生存率(overall survival, OS)已分别达70%和80%以上1-4，儿童ALL已成为一种可治愈性疾病(curable disease)，而非既往认为的不治之症(fatal disease)。尽管如此，仍有约20%左右的儿童ALL出现治疗失败(treatment failure)或复发(relapse)，这是目前儿童ALL治疗中亟待解决的问题。 随着基础生命医学科学的进步和发展，已发现了多种与白血病发生发展密切相关的遗传和环境因素，新型细胞遗传学(cyto
22、genetcics)、基因组学(genomics)和蛋白质组学(proteomics)等分子生物学技术的应用，揭示了传统技术和方法难以发现的与白血病发生发展和预后密切相关的“细微异常”改变。但由于ALL是一组高度异质性的恶性造血系肿瘤，目前仍未完全阐明其发病机制。既往大量研究已经证实，白血病的发病(leukemogenesis)与各种癌基因5、抑癌基因6和转录因子7等的异常表达密切相关，而且不同亚型可能涉及不同的信号传导途径。Ikaros家族锌指蛋白1 (Ikaros family zinc finger 1, IKZF1)为一种极为重要的造血转录调节因子，属锌指蛋白家族成员，尤其在淋系造血(
23、lymphopoiesis)方面发挥着关键性调控作用8-10。人类IKZF1基因定位于7p1211.12，其编码的蛋白产物Ikaros与小鼠Ikaros蛋白同源性高达95%，具有高度的进化保守性。由于IKZF1基因的“可变剪接”(alternative splicing)，至少具有8种不同的可变剪接转录本(spliced transcripts)，从而相应编码8种蛋白异构体(isoform)。不同转录本及其相应的蛋白产物Ikaros (IK)，简称为IK1IK8。IK具有高度的种属进化保守性和相似蛋白结构。C端均具有1个共同的双向性转录激活功能域(transcription activatio
24、n motif)和2个锌指结构域(zinc finger domain)，后者与IK相互间形成杂(或纯)二聚体以及与其他Ikaros家族蛋白(如Aliolos和Helios)的相互作用密切相关。但各种IK异构体的差异主要表现在N端锌指结构(F1-F4)的组成及其DNA结合能力和转录活性。IK至少必须具有3个N端锌指结构才具有与DNA结合的高亲和力，从而发挥转录调节作用。IK1、IK2和IK3均具有3个以上的N-端锌指结构，它们表达于细胞核，属于“功能性或活性IK异构体”(functional or active IK isoforms)。IK4IK8因N端锌指结构少于3个而无DNA结合能力，并
25、表达于胞浆，但可与功能性IK形成杂二聚体从而影响后者与DNA的结合和转录调节作用，发挥所谓“显性负效应”，因而被称为“显性负异构体”（dominant negative isoforms）。 国外学者大量研究已经充分表明，功能性IK及其与“显性负”IK异构体间的相互平衡制约，在维系造血细胞尤其是淋巴细胞的分化和发育方面发挥着极为重要的调控作用，IK已被普遍认为是淋系造血的关键性转录调节分子（master transcriptional regulator）13.14。 IK异常表达也是白血病发生发展过程中极为常见的现象。研究发现，“显性负”IK异构体表达于各种白血病细胞株15、成人和儿童B系A
26、LL、T系ALL和急性髓性白血病16-18。如小鼠因IK突变导致功能性IK无表达，或“显性负”IK高表达，则快速发生白血病和淋巴瘤19。更为重要是，近年研究发现，“显性负”IK异构体在某些具有特定非随机性细胞遗传学/分子生物学异常的ALL表达明显增高，如具有MLL基因重排的婴儿ALL、Ph+ALL等，并与这些ALL的不良预后、耐药和复发密切相关，高度提示IK异常表达也可能是反映和预测ALL长期预后的一个独立不良预后因素20-26。 据文献检索，目前国内关于IKZF的研究报道极少，仅查询到一篇关于成人B系ALL患者Ikaros基因改变的会议摘要27。为了进一步了解我国儿童ALL患者IKZF1基因
27、的表达情况，尤其是IK与ALL患儿临床常用预后危险因素的关系，我们借鉴国外相关文献的方法，采用巢式PCR方法，检测了43例儿童ALL患儿骨髓IKZF1基因各种可变剪接转录本的表达情况，分析其与儿童ALL预后因素的相关关系。材料与方法一、 材料1. 主要试剂人淋巴细胞分离液中国医学科学院生物工程研究所Trizol试剂美国Invitrogen公司ReverTra Ace组合型逆转录试剂盒博瑞克生物技术有限公司2Taq PCR Mastermix北京天根生物技术有限公司100bpDNA Maker天津生化科技北京有限公司三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇等国内分析纯产品DEPC美国sigma公司2. PCR
28、引物的设计与合成根据NCBI基因库(Genebank) IKZF1mRNA(NM_006060)和管家基因GAPDH mRNA序列(NM_002046)设计基因特异性引物, 由Invitrogen公司合成。为了提高扩增特异性，对IKZF1基因采用巢式PCR扩增，参照文献设计两对引物28，而且两对引物的上游和下游引物序列均分别对应于IKZF1基因的第1号外显子和第8号外显子，从而保证能扩增出全长IKZF1转录本(full length transcript)和可能出现的所有可变剪接转变本(alternatively spliced transcripts)。具体如下:IZKF1基因第一轮PCR引
29、物序列上游引物 F15-CAC-ATA-ACC-TGA-GGA-CCA-TG-3(20mer)下游引物 R15-AGG-GCT-TTA-GCT-CAT-GTG-GA-3(20mer)IZKF1基因第二轮PCR引物序列上游引物 F25-ATG-GAT-GCT-GAT-GAG-GGT-CAA-GAC-3(24mer)；下游引物 R25-GAT-GGC-TTG-GTC-CAT-CAC-GTG-G-3(22mer)管家基因GAPDH引物序列上游引物 F35-GGA-AGG-TGA-AGG-TCG-GAG-T-3(19mer)下游引物 R35-TGA-GGT-CAA-TGA-AGG-GGT-C-3(19
30、mer)3. 主要仪器KDC-1042低速离心机科大创新股份有限公司中佳分公司Eppendorf-5108冷冻离心机德国Eppendorf公司HC-2516高速离心机科大创新股份有限公司中佳分公司DU730紫外可见光分光光度计美国Beckman Coulture公司C-100 Thermal cycler美国Bio-Rad公司Universal凝胶图像分析系统美国Bio-Rad公司电子天平上海精密科学仪器有限公司 二、 研究对象实验组：系我院(四川大学华西妇产儿童医院)儿童血液肿瘤科2007年至2009年收治的新诊ALL患儿43例，年龄1.215岁，平均年龄8.15岁。其中男性29例，女性14
31、例。根据我国儿童ALL诊治标准，主要依据骨髓形态学和免疫表型检查结果明确诊断。根据年全国协作组诊治方案所定临床危险组划分标准，本组AL患儿包括标危组 15例、中危组12例、高危组16例；泼尼松敏感组31例，泼尼松不敏感9例；初诊外周血WBC50109/L者14例，初诊外周血WBC50109/L 29例；对照组：为我院儿童保健科门诊定期常规体检的20名健康儿童，年龄113岁(平均年龄：5.12.9岁)，其中男性10例，女性10例。经统计学分析，实验组和对照组儿童年龄(P=0.052)和性别(P=0.334)分布无统计学显著差异。三、 研究方法1. 标本采集 ALL患儿初诊时骨髓标本的采集：经拟诊
32、ALL患儿的法定监护人签署知情同意书后，进行骨髓穿刺检查，收集患者骨髓标本进行形态学等诊断必须的检查，额外的骨髓标本用于本实验。每份抗凝骨髓标本约12ml。共43份。4小时内分离骨髓单个核细胞(具体方法下述)，-20C条件下保存备用。 健康儿童EDTA抗凝外周血标本的采集：收集于我院儿童保健门诊进行常规体检(包括血液常规检查)的健康儿童外周血标本12ml，EDTA抗凝，4小时内分离单个核细胞(具体方法下述)，-20C条件下保存备用，共20份。2. 淋巴细胞分离液密度梯度离心法提取制备单个核细胞 将新鲜收集的外周血或骨髓抗凝标本12ml，加入等量DEPC处理的PBS(0.01mM)缓冲液稀释；
33、于10ml灭菌离心管内加入适量淋巴细胞分离液，然后沿离心管壁小心PBS稀释的抗凝标本，室温下20002500rpm离心20分钟。 离心后用巴氏吸管小心吸取第二层乳白色单个核细胞层，转移至另一灭菌去酶刻度离心管，DEPC处理的PBS缓冲液清洗后离心5分钟(1500rpm)。 单个核细胞沉淀(cell pellet)中加入1ml Trizol试剂，反复吹打直至细胞沉淀充分融化，然后将单个核细胞悬液转移至1.5ml Eppendorf微量离心管，静置数分钟后于-20C保存备用。3. 单个核细胞总RNA 的提取制备：采用Trizol试剂提取细胞总RNA，按照试剂说明书进行。具体过程简述如下： 将溶解于
34、Trizol试剂的单个核细胞室温下静置56分钟，然后加入200ml氯仿，剧烈震荡混匀，室温下静置23分钟； 离心15分钟(4C，12000rpm)后，小心吸取上层水相转移至另一EP管，加入500l异丙醇，轻轻震荡混匀，室温下静置10分钟； 再次离心10分钟(4C，12000rpm)，可见管底少量胶状沉淀； 弃上清，用DEPC水配制的75%乙醇洗涤RNA沉淀；然后离心5分钟(4C，7500rpm)； 然后烘干提取制备的细胞总RNA(50C60C)，并用DEPC处理的水溶解RNA，分装后-70C冰箱内保存备用； 取2ml RNA样品，紫外分光光度计内测定RNA的纯度及浓度。4. 逆转录制备cDNA
35、采用ReverTra Ace组合型逆转录试剂盒(博瑞克公司产品)逆转录制备cDNA，按试剂盒说明书操作，具体如下反应体系和反应条件如下：制备的cDNA于-20C 条件下保存备用。试剂每一反应体系中的加样量 (ml)5RT Buffer4dNTP Mixture 2Super RI0.5RT-Enhancer0.5oligo(dT)18(50pmol/l)1RNA模板(1g)XReverTra Ace1RNase Free H2O11-XTotal Volume20逆转录反应条件：42C40分钟5. 管家基因PCR扩增反应验证逆转录是否成功 采用2Taq PCR Mastermix试剂盒进行PC
36、R扩增反应，按照试剂盒说明书进行操作，总反应体积25ml。具体如下：试剂每一反应体系中的加样量 (ml)2Taq PCR Mastermix12.5上游引物(10Mm)1下游引物(10Mm)1cDNA模板XddH2o10.5-X总反应体积25首先进行管家基因的PCR反应，如出现预期的清晰单一PCR扩增条带，表明逆转录成功，制备的cDNA可用于IKZF1目标基因的巢式PCR反应。PCR反应条件为：95C预变性3分钟，然后95C 30秒，58C30秒，72 30秒，共30个循环，最后72C 5分钟。 PCR扩增产物凝胶电泳：将PCR扩增产物5ml加样于2%琼脂糖凝胶进行电泳(电压120V)后，然后
37、采用凝胶图像分析仪进行电泳图像采集和分析。6. 巢式PCR检测IZKF1基因表达情况为了提高IZKF1基因的扩增特异性，采用对应于IZKF1基因的第1号外显子和第8号外显子的两对引物进行巢式PCR反应，保证能扩增出全长IZKF1转录本和可能出现的所有可变剪接转变本。第一轮PCR反应体系和反应条件于0.2ml无菌薄壁PCR反应管中加入2l cDNA模板进行巢样式PCR第一轮反应，具体反应体系如下：反应体系l/管cDNA模板2上游引物 F1(10pmol/L)1下游引物 R1 (10pmol/L)12*Taq Master Mix12.5ddH208.5总反应体积25第一轮巢式PCR的反应条件为：
38、首先于95C变性5分钟， 95C30秒；60C45秒；72C30秒；然后进行35个PCR循环，最后72C终延伸5分钟。第二轮PCR反应体系和反应条件取第一轮PCR扩增产物0.5l与9.5l ddH20混合（稀释20倍），然后从中吸取1l作为第二轮PCR反应的模板，具体反应体系如下：反应体系l/管cDNA模板1上游引物 F1(10pmol/L)1下游引物 R1 (10pmol/L)12*Taq Master Mix12.5ddH209.5总反应体积25第二轮巢式PCR的反应条件为：首先于95C变性5分钟，然后进行35个PCR循环，95C30秒；62C45秒；72C30秒；最后72C终延伸5分钟。
39、PCR扩增产物同样于2%琼脂糖凝胶进行电泳(电压120V)和凝胶图像分析。7. DNA测序为了验证是否真正扩增出了全长IKZF1转录本及其多种可变剪接转录本，从琼脂糖凝胶上剪切下与对应于IKZF1各种转录本大小的清晰电泳条带，分别纯化后送天根生化科技(北京)有限公司进行DNA测序，并要求对大片段扩增产物进行双向测序。DNA测序结果经NCBI BLASTN在线软件进行比对和验证。四，统计分析采用卡方检验比较组间或多组间IK阳性表达率，以P0.05作为判断有无统计学显著性差异的标准。结 果一、 RNA纯度和完整性的检测采用分光光度计检测提取制备的RNA样品OD值。如OD260/OD280介于1.6
40、2.0，表明提取制备的RNA纯度较好。将RNA样品于1%琼脂糖凝胶电泳(电压130V) 20分钟，可见28S、18S和5S三条清晰明亮的条带(图1)，表明提取制备的RNA无明显降解及污染，纯度较高。图1.部分标本RNA电泳图二、 普通PCR验证逆转录是否成功采用GAPDH管家基因特异性引物和上述方法部分所述反应体系和条件，进行普通PCR扩增反应，验证逆转录是否成功。PCR扩增产物于2%琼脂糖凝胶电泳后，结果检测出对应于预期大小的单一清晰条带，证实逆转录成功，制备的cDNA可用于目标基因IKZF1的巢式PCR反应。图2. 部分标本GAPDH管家基因普通PCR扩增结果三、 IKZF1基因巢式RT-
41、PCR扩增结果按方法部分所述反应体系和条件，分别以两对IKZF1基因特异性引物进行两轮PCR反应，检测IKZF1基因表达情况。结果发现： 健康对照儿童外周血单个核细胞表达各种IKZF1可变剪转录本，包括显性负转录本。从图3可以比较直观地发现，健康对照儿童外周血单个核细胞表达的IKZF1转录本中，IK2表达水平最高并表达于所有20例对照组外周血单个核细胞(除对照8)，提示IKZF1基因编码的野生型Ikaros蛋白（如IK2）在正常造血方面具有重要调节作用，而显性负异构体的表达可能也发挥着重要的平衡制约调节作用。图3.部分健康对照组儿童外周血单个核细胞IKZF1表达情况 43例ALL患儿骨髓单个核
42、细胞也表达IKZF1各种可变剪接转录本，但不同ALL患儿IKZF1可变剪接转录本表达情况差异很大，部分患儿以IK6和IK8等显性负转录本表达为主(图4)。ALL患儿IKZF1基因表达情况或可变剪接本的表达谱(expression pattern)与健康对照儿童具有很大的差异，进一步印证了国外学者的研究报道，高度提示IKZF1基因的异常表达(显性负转录本编码的Ikraos异构体蛋白)与白血病发病可能具有极为密切的关系。图4. 部分ALL患儿骨髓单个核细胞IKZF1表达情况四、 DNA测序结果为了验证是否真正扩增出了各种IKZF1可变剪接转录本，我们选择了与各种可变剪接转录本预期大小对应的6种第二
43、轮PCR扩增产物进行测序，经NCBI BLASTN在线软件进行了比对和验证，并根据IKZF1 mRNA (NM_006060)全长序列和外显子位置进行分析判断。测序结果证实，我们送检的PCR扩增产物之一包含IKZF1基因第2号外显子的部分序列、外显子37的所有序列，以及对应于第8号外显子5-端的部分序列(设计的IKZF1基因特异性下游引物序列正好对应于这段序列)，相似性达99%，从而证实为IK1 (图5，图6)。同样方法证实，其他第二轮PCR产物分别为IK2、IK4、IK6和IK8。图5：第二轮PCR产物之一测序结果图6：第二轮PCR产物测序后Blast Search结果表明与IZKF1 mRNA序列同源性高达99%五、 研究对象单个核细胞IKZF1基因表达情况根据正常对照儿童外周血单个核细胞和ALL患儿骨髓单个核细胞IKZF1各种可变剪接表达本的电泳条带位置，结合测序结果，确定IKZF1基因各种可变剪接本的表达情况。标本阳性表达IK剪接本标本阳性表达IK剪接本4ik1+ik212ik2+ik4+ik65ik1+ik2+ik4
