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1、核酶抗肿瘤和抗病毒作用的研究进展摘要 酶大多数是蛋白质，也有少数具有生物催化活性的大分子，比如RNA、DNA。而核酶（Ribozyme，Rz）就是一类具有生物催化活性的RNA。底物是RNA分子的核酶，可催化底物分子RNA的切割和剪接。其作用特点是：切割效率低，易被RNase破坏。催化类型包括RNA的转核苷酰反应、RNA限制性内切酶的反应（水解反应）和聚合酶活性反应（连接反应）等；还可能具有氨基酸酯酶、氨基酰tRNA合成酶和肽基转移酶的活性，表明核酶在翻译过程中和核糖体发挥功能中起着重要的作用。目前发现的核酶包括有：类内含子、类内含子、RNaseP、锤头状，发夹状、斧头状核酶(丁型肝炎病毒核酶)
2、。近些年的研究证实，核酶普遍存在于自然界，其二级结构是由氨基酸臂、二氢尿嘧啶环、反密码环、额外环、TC环五部分组成。核酶是催化剂，可以被反复利用，因此与反义RNA相比，核酶药物使用剂量较少，作用大，毒性也较小，而且核酶对病毒作用的靶向序列是专一的，因此病毒较难产生耐受性。利用核酶剪接作用的高度专一性治疗相应疾病具有长远的应用前景。目前，核酶技术是一种很有应用前景的基因治疗手段，尽管在20年里有了巨大的发展，但还有许多问题没有解决，如体外筛选活性高的核酶，加强对发荚状(Hairpin ribozyme)、斧头状核酶(The axe of ribozyme)的研究，建立体内高效表达系统，增强核酶在
3、细胞内的切割效率、寻求更加有效的载体等。这些问题的解决，使核酶在临床应用的时间进一步缩短。目前虽然核酶的抗肿瘤和抗病毒作用还处于实验研究阶段，但已经露出了希望的曙光。这篇文章就近几年来核酶在抗肿瘤和抗病毒作用治疗中的应用进行简要概述。关键词：核酶；抗肿瘤；抗病毒The research progress of ribozymes antitumor and antiviral effect Author: Wang Ruanna Tutror: Li Hongming AbstractRibozyme is a catalytic RNA having a biological activit
4、y. The ribozyme substrate is a RNA molecule, which catalyze the RNA cutting and splicing. Its function characteristics are: low cutting efficiency, easy to damage by RNase; catalytic types include RNA nucleotidyl acyl reaction, hydrolysis reaction (RNA restriction endonuclease reaction) and connecti
5、on reaction (polymerase activity); also may have amino acid esterase, aminoacyl tRNA synthetase and peptidyl transferase activity, showed that ribozyme play plays an important role in Translation process and ribosome function. Currently found in the ribozyme includes: a class of intron, intron two c
6、lass, RNaseP, hammerhead, hairpin, axehead ribozyme (HDV ribozyme). In recent years, confirmed, ribozyme exists widely in nature, its secondary structure has been studied clearly.Ribozyme is the catalyst that can be repeated action, compared with antisense RNA, ribozymes less medication dosage, toxi
7、city is also smaller, and the role of the virus ribozyme targeting sequence is specific, and therefore more difficult to produce virus tolerance. Splicing ribozyme use of highly specific diseases treatment corresponding application. Ribozyme technology as a promising tool in gene therapy, although 2
8、0 years have had great development, but there are many problems remain to be solved, such as the ribozyme in vitro screening of high activity, strengthen the research on lenticular, axe ribozymes in vivo expression system, the establishment of efficient, enhance ribozyme within cells. The cutting ef
9、ficiency, seek more effective vectors etc. To solve these problems, will undoubtedly make the ribozyme to further shorten the time in clinical application. Although the ribozyme antiviral, antitumor effects are in the experimental stage, but has been exposed to the dawn of hope. With the further glo
10、bal science and technology workers efforts, the anti-tumor therapy ribozyme antiviral, certainly will have brilliant prospects.Articles on recent years ribozyme used in anti-viral and anti-tumor therapy briefly.Key words: ribozyme;anti-virus;anti-tumor目 录1前言 12核酶在抗肿瘤中的作用 12.1抗肿瘤血管形成靶向治疗 12.2核酶抑制端粒酶活
11、性 12.3 核酶抗肿瘤增殖 22.4 核酶抗多药耐药 22.5其他作用 33核酶在抗病毒中的作用 3 3.1 抗乙型肝炎(HBV)病毒 3 3.2 抗慢性丙型肝炎(HCV)病毒 4 3.3 抗丁型肝炎(HDV)病毒 4 3.4 核酶抗人类免疫缺陷病(HIV)病毒 5 3.5 核酶在植物抗病毒的研究 6 3.6其它作用 7结论 8致谢 9参考文献 10 1前言核酶 (Ribozyme，Rz)是一类独特的RNA分子，具有锤头状(Hammer head shape)、发夹状(Hairpin)和斧头状(The axe shape)三种基本结构。锤头状是核酶最简单的二级结构。现在人们已成功地设计并合成
12、了具有自我剪切和催化功能的核酶。核酶具有序列特异性，没有免疫活性是因为不编码蛋白，又可以反复被利用等优点。目前已经广泛应用于基因治疗领域。人工设计的催化分子间反应的核酶是根据催化分子内自我剪切的核酶所得出来的，并能够在固定点切割酶的靶序列。核酶自身的主要功能特点和阻断基因表达的主要依据是特异性切割RNA。这一点为控制有害基因如病毒基因、癌基因的表达提供了新的研究方案。现在本文将核酶在这一方面的研究应用进展作简要概述。 2核酶在抗肿瘤中的作用2.1核酶抑制血管形成靶向治疗 核酶（Ribozyme，Rz）是一类具有生物催化活性的RNA分子。有效地阻断特定基因的表达，发挥其生物学功能是因为核酶能够在
13、固定点处切割特定的mRNA分子。Czubayko等1人工合成了针对多效因子（pleiotrophin，PTN）的核酶，并将这个多效因子转染到能高度表达PTN的人黑色素细胞系。研究结果显示，PTN Rz使转染细胞PTN 的水平降低。虽然在体外试验中，黑色素瘤细胞的生长并没有因为PTN的降低而受到抑制，但在裸鼠试验中证实，PTN的降低确实遏止了肿瘤生长和新生血管生成，增加了肿瘤细胞的凋亡，并且使肿瘤的转移得到了抑制。Pavco等2设计的mRNA是利用化学性质稳定的核酶特异性剪接VEGF受体（VEGFR-1，VEGFR-2）而得出的，使裸鼠结肠癌转移的发生得到了明显的抑制。该研究结果发现，利用人工合
14、成核酶治疗大肠癌是一个新的途径则。作为作用于VEGF受体mRNA的一种核酶Angiozyme，通过分解VEGF的Flt-1受体而发挥作用是它的主要作用机制，并且没有明显的毒性作用。现在Angiozyme核酶正在进行恶性肿瘤晚期的临床研究，初步显示Angiozyme的耐受性较好，且有较小的毒性反应。2.2核酶抑制端粒酶活性端粒酶(telomerase)是一种由蛋白和RN A两部分组分构成的核蛋白复合物(Nucleoprotein complexes)。在细胞分裂时，它以人自身端粒酶RNA (human telomerase RNA，hTR )组分为模板，催化合成染色体顶端端粒酶的顺序，找回端粒酶
15、丢失的部分，从而使细胞得到永生化。恶性肿瘤的形成和发展与端粒酶的激活有密切的联系。研究结果表明，端粒酶RNA组分的表达以及端粒酶活性会随着肿瘤细胞诱导分化的降低而减弱。这使得人们对肿瘤细胞失去永生化能力产生浓厚的兴趣，肿瘤细胞失去永生化是通过抑制端粒酶活性来实现的，而抑制端粒酶活性是由减少hTR组分实现的。Yokoyama等设计了靶向hTR35、170、315位的锤头状核酶(Hammer head shape ribozyme)。在细胞外体系中，该锤头状核酶能够有效的切割RNA底物。在1-Shikawa细胞系(一种子宫内膜瘤细胞)中，有一种核酶能够抑制端粒酶活性，方法是将该核酶克隆到载体并使其
16、表达，进而导入到另一子宫内膜瘤细胞株AN3CA中，以此来降低端粒酶的活性、RNA水平3。2002年，国内学者屈艺等4在hTERT mRNA 2 239bp处设计了一个核酶，该核酶的结构是锤头状，并将其转导入到人宫颈癌细胞和人肝癌细胞中。结果发现端粒酶活性有显著的降低，并加速了细胞的凋亡。2.3核酶抗肿瘤增殖 ras基因家族是由H-ras、K-ras和N-ras三种基因组成。研究结果已经证实在细胞发育和肿瘤发生中起重要作用的是ras基因家族成员。肿瘤可以使ras基因家族中的基因发生突变，这一突变会使GTP的结构在结合位点处也发生变化。虽然突变型的ras基因表达出来的蛋白仍然保持其催化活性，但降低
17、了水解GTP的能力，因而会自主地激发细胞的生长、分化。因此，特异性抑制ras癌基因的突变是基因治疗抗肿瘤的一项重要方法。核酶的序列能够靶向且特异性抑制mRNA，故能够把正常ras基因和突变ras基因区别开来。根据这个结果的显示，Irie等5在1999年设计出了一种针对ras癌基因突变的锤头状核酶，他们做的实验是该锤头状核酶在体外及裸鼠体内观察对膀胱癌的治疗作用，其结果明显使肿瘤的生长得到了抑制，并且两者呈效量关系。Tsuchida6和Kijima等7设计出针对K-ras基因的第12位密码子结构为锤头状的核酶，经过腺病毒得介导转染到胰腺癌的Capan-1细胞株，这样可以抑制该癌细胞的增殖，逆转其
18、恶性表现型，得到控制癌基因扩散的结果。在此之后，Zhang8也设计出了针对K-ras基因的第12位密码子的锤头状核酶，该实验是在体外及动物模型内观察此锤头状核酶对肺癌非小细胞的治疗作用。研究结果显示，此人工合成的核酶比单纯反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotides nucleotides)治疗更为有效。2.4核酶抗多药耐药 多药耐药9 (multidrug resistance，MDR)是指肿瘤细胞对化疗药物的原发性(Primary)或继发性(Secondary)的抵抗现象。肿瘤细胞MDR-1基因的扩增是它产生的机制之一，它编码的P-糖蛋白(P-glycoprotein
19、，P-gp)与多药耐药相关蛋白(multidrug resistance protein，MRP)会将胞浆内针对它的化疗药物排到细胞间隙中，使胞浆内的化疗药物浓度下降。肿瘤患者对化疗的敏感性增加是由于P-gp的过度表达，但是许多肿瘤患者在化疗以前就有了MDR-1基因的高度表达，即肿瘤的原发性耐药(Primary drug resistance)或内在性耐药(intrinsic resistance)，且在化疗后的比例会变得更高。因此许多学者应用反义单核苷酸切割技术来控制P-gp蛋白的表达，改善肿瘤患者在化疗后期的治疗。Gao等10在体外经转录酶合成了针对MDR-1基因的锤头状核酶，在克隆人细胞
20、逆转录病毒载体pCEAMR中，转染结肠癌细胞株SW1116R。产生CEA的该细胞株，可以对阿霉素有抵抗作用并抑制MDR基因的表达。作者发现在细胞中这种锤头状核酶可以稳定的表达，并且抑制MDR-1 mRNA基因的表达以及P-gp的水平明显降低。该细胞对阿霉素(adriamycin)的抗药性下降了93.1。Holm选用密码子880处的GUC三联体并且设置37端为切点，设计了针对MDR-1 mRNA 的锤头状核酶，实验结果证明实了MDR-1 mRNA核酶在细胞间隙中也能够有效地、特异性地在GUC处切割MDR-1基因。应用哺乳动物表达载体PH beta Apr-1 neo将Rz基因导入胰腺癌细胞株EP
21、P85-181 RDB中，可以抑制P-gP的生成，明显减少了EPP85-181 RDB对柔红霉素的抗药性。MDR的产生与c-fos癌基因的表达增加有关。Scanlon将切割c-fos mRNA的核酶质粒转染到人类卵巢癌细胞株A2780AD中，结果是该A2780AD细胞株对放线菌素D有抗药性，并伴有MDR的表现型。发现抗fos mRNA的核酶可以使c-fos的表达减弱，同时降低了MDR-1基因、c-jun基因、突变型p53基因的水平，并使对化疗药物的敏感作用得到恢复。这个结果也进一步证实了c-fos基因在药物抗药性方面起重要作用是通过参与信号转导的途径而实现的。2.5其它作用 随着现在许多医疗技
22、术人员对更多细胞因子和蛋白的研究进展，人们开始重视其他蛋白因子对肿瘤血管生成的影响，并将对核酶的研究也在其中体现11。Abounader等12的研究显示，将U1 snRNA/ribozymes用于神经胶质瘤的治疗，可抑制肿瘤的生长、增殖以及使肿瘤SF/HGF和c-met基因的表达水平降低。对用U1 snRNA/ribozymes处理后的肿瘤细胞进行组织学检查。结果表明，血管的密度显著降低，也增加了肿瘤细胞的凋亡。将带有抗SF/HGF 和抗c-met基因的U1snRNA/ribozymes的腺病毒载体经肿瘤细胞注射到颅内移植有神经胶质瘤的动物体内，结果可充分抑制肿瘤的生长及增殖，使动物存活率升高
23、。如果想要达到同样的效果也可以静脉注射U1snRNA/ribozyme脂质体复合物。Jiang等13针对人HGF/SF 受体(pLXSN-MET)或HGF/SF受体 (pLXSN-HGF)的核酶基因建立了含有编码特异性逆转录病毒载体。并用这一载体分别转染到裸鼠乳腺癌模型肿瘤细胞MDA MD 231和成纤维细胞株的MRC5细胞中。实验结果证明，人工特异性合成针对HGF/SF及其受体的核酶可以减少乳腺癌细胞的生长、增殖，同时通过抑制肿瘤细胞在细胞间质分泌物的相互作用来减弱肿瘤细胞对血管生成的控制。低氧诱导因子-I(HIF-I)可在快速生长的肿瘤中特异性表达，通过上调某些糖酵解酶、亚型糖酵解蛋白的表
24、达活性，并增加葡萄糖的转运载体和转运蛋白质的活化，从而使肿瘤细胞的无氧代谢增加，继而增加胞膜药物外排的能力、红细胞生成以及血管生成的相关基因的表达，使局部缺血缺氧的肿瘤细胞免于死亡并维持增殖14。3核酶在抗病毒中的作用3.1抗乙型肝炎(HBV)病毒乙型肝炎病毒(Hepatitis b virus，HBV)是引起乙型肝炎的病原体(Pathogens)。在我国HBV感染率高达10，然而传统的抗乙型肝炎病毒药物远期的治疗效果都不太明显，现在迫切需要寻找新型抗HBV的药物。截止到目前，人们发现的核酶共有六种类型：即I类内含子、类内含子、RNaseP、锤头状核酶(Hammer head shape ri
25、bozymes)、发夹状核酶(Hairpin ribozymes)和丁型肝炎病毒核酶（斧头状核酶:The axe of ribozymes）。通过对这六种核酶的组成及结构的深入研究，研究人员已经逐步开始利用锤头状、发夹状核酶的性状及特点，人工合成研究人员自己所需要的核酶。Weizsacker15、汤华16、竺来发等人17所设计的针对HBV的核酶，均采用传统的方式而制得的。Hseih等18则研究抗HBV的核酶对乙型肝炎病毒的阻断作用。在血清和细胞内含有大量的核酸酶，这可能导致体内表达的核酶被降解。因此，现在的大多数研究在于提高体外合成核酶的稳定性。在体外许多研究人员为了增加核酶的稳定性而针对2-
26、OH进行有目的的修饰。一些研究通过装在tRNA反密码环或在核酶末端引入茎环结构来提高核酶在细胞内的稳定性。连建奇发现一种有效的方法来提高核酶在细胞内的稳定性，就是在核酶两端设计顺式核酶19。3.2抗慢性丙型肝炎病毒(HCV)慢性丙型肝炎病毒(Chronic hepatitis c virus，HCV)是正链RNA病毒。此病毒是导致慢性肝炎病发的主要原因。目前干扰素a及利巴韦林来治疗HCV，通常联合治疗效果更佳21。高度变异性是HCV的特性之一，因此对抗HCV药物的研制面临着巨大的挑战。一些有潜力的抗HCV药物目前正在研制中，如蛋白酶抑制剂，但此抑制剂存在一个无法避免的缺陷，即病毒能够对该抑制剂
27、产生耐药性。为了防止病毒突变而产生的耐药性，Welch 等将多个高度保守HCV的正链RNA和负链 RNA序列置于腺病毒载体或腺病毒相关载体上，同时制得了多种抗HCV的核酶。体外实验研究表明，核酶能够使正链RNA 和负链RNA序列得到降解。3.3抗丁型肝炎(HDV)病毒丁型肝炎病毒(Hepatitis b virus，HDV)为一个缺陷性环状负链RNA病毒，含有长约1.7 kb的基因组。其中两条基因组可以自我分裂，这两条基因组分别是基因链和抗基因链。目前的研究认为，在基因链上的760-715d、726- 731、762-766位的核苷酸形成一个二级结构，其形状为斧头状。与抗基因链结构自裂有关的是
28、位于抗基因链上的80-84、862- 871、897-902位的核苷酸结构。Branch的研究发现，抗HDV的斧头状核酶能够对异体靶细胞RNA进行切割，且具有较高的切割效率21。Roy等(1997年)通过计算机辅助二级结构预测和RNase敏感性分析来确定HDV mRNA上潜在的切割位点，由此得到的核酶选择性地抑制HDV的复制并在靶位点处构建delta。人工构建的delta核酶在体外以不同的底物进行检验它的切割活性，切割效率最高的核酶可在体内将用于试验的研究22。Roy等(1998年)又进行了delta核酶切割野生型(Wilde type)和突变型(Mutant type)HDV的研究，其结果显
29、示：(1)delta核酶可以被多次利用，即多个HDV mRNA分子可以被一个核酶分子连续切割。(2)核酶并不是只在C/UGN6 (一段HDV mRNA序列)处有切割活性，delta核酶切割在切割位点上游含有高鸟苷酸残基的底物更容易比切割野生株底物。所以，Roy认为delta核酶作为一个具有催化活性的RNA，可进一步用于基因治疗研究23。HDV-RNA自身切割活性与其复制有关，Chen等(1997年)认为抑制HDV的复制可通过抑制HDV基因的核酶活性来达到效果。氨基苷(aminogl ycosides)是一类对HDV核酶活性起很强的抑制作用的抗生素，它用于抗HDV的治疗是很有希望的24。3.4核
30、酶抗人类免疫缺陷病(HIV)病毒人类免疫缺陷病(HIV)的治疗具有很大挑战性的原因，是由于HIV致病机制的复杂性以及HIV基因的高度变异性决定的，而核酶为治疗HIV提供了一种新的基因治疗方案。在20世纪90年代初，人们发现核酶在细胞中对抑制HIV-1的繁殖具有有效性，基因治疗研究就是从那时侯开始的。目前，核酶治疗HIV-1感染已经进入了人类临床试验阶段。人类免疫缺陷病(HIV)病毒是RNA病毒，根据HIV基因组的基本结构，人们成功地设计了针对所有HIV-1不同结构的RNA核酶，并成功介导进入核酶基因，转入CD4+细胞或细胞株的基因治疗，并且取得了显著的效果。Medina MF等用一种特殊的接头
31、酶把一种锤头状核酶和人类tRNA 3，端赖氨酸的反密码环相连起来；核酶以HIV-1env基因的编码区作为作用点，并将tRNA 转导入人 CD4+T细胞系是通过逆转录病毒载体而实现的。研究结果表明，核酶抑制HIV-l的复制得到了极大的提高25。Klebba C 等人工设计的核酶转导入感染HIV-1的人CD4+T细胞和Hut 78 细胞是经逆转录病毒载体来完成的，结果也表明核酶抑制上述两种细胞所感染的HIV-1基因的复制26。目前已经有多项应用核酶技术的HIV基因治疗策略获准进入临床I期实验研究并取得了令人兴奋的成果。Wong-Steal F等用核酶转导入HIV-1感染者自己体内淋巴细胞，以切割H
32、IV-1 RNA为目标，从而该核酶的活性抑制了肿瘤细胞的增殖。初期实验结果表明，经过核酶转导的T细胞在感染HIV-1的病人体内可以生存很长时间且是安全的。随着逐步发展的分子生物学和成熟的基因治疗方法，不久的将来临床抗HIV的感染将被基因治疗方法所取代。3.5核酶在植物抗病毒的研究烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus ，TMV)是分布广泛、侵染性很强的一类植物病毒，能感染我国30个科中的199种植物，在我国对烟草、蔬菜、花卉等植物的生长具有严重的危害。这些年以来，随着人们对核酶的深入研究，在植物中利用核酶进行抗病毒研究已成为新的热点。许多研究者根据TMV基因组的基本结构，成功合
33、成了针对TMV不同识别位点的核酶，并取得了显著的成果。杨建华等(1998)将核酶Rz-2转化到烟草原生质体中，这个Rz-2是他们设计的特异切割烟草花叶病毒RNA 的锤头状核酶。通过对烟草原生质体侵染性的检测发现，转基因原生质体中TMV 侵染程度比未转基因的对照组明显降低27。水稻条纹叶枯病(Rice stripe disease)是水稻主要病毒病害之一。在我国该病是在1964年首次被报道出来，至今仍多次暴发流行，严重威胁了水稻的生产。引起该病的水稻条纹叶枯病毒(Rice stripe virus，RSV)，是一类特殊的单链、多组分RNA 病毒28。RSV是经由飞虱传播，并能在飞虱体内生长增殖，
34、经卵传递给下一代飞虱。在基因结构和组成上与侵染动物和人体的Phleboviruses (白蛉)和 Unkuviruses病毒相近似29。刘力等(1996)根据RSV的基因序列，在分析其分子结构及病理特征的基础上，成功设计并合成了对水稻条纹叶枯病毒RNA保守区及病害特异性蛋白(Disease specific protein，DSP)基因进行特异性切割的核酶30。病毒RNA保守区位于各RNA链的5，-末端与3，-末端，每一条链5，-末端保守区的核酸序列完全一致，3，-末端与5，-末端的序列则几乎全部相同31。一些研究者认为，病毒RNA的识别、复制、装配与该区域有很大的关系。若这个区域被核酶破坏，
35、病毒就非常困难的进行自身的基本增殖。而DSP蛋白是在致病过程中出现的，这种由病毒RNA4编码的蛋白，在细胞中感病品种的量很多，而抗病品种的量相对很少32。体外切割实验表明，人工所设计合成的核酶能够RSV病毒的活性30。薯卷叶病毒(Potato leafroll、virus，PLRV)是由蚜虫以持久方式传播的一种病毒33，属黄化病毒组(Luteovirus)，可引起马铃薯植株黄化(yellowing)、矮缩(dwarf virus)、卷叶(leat)、僵化(rigid)等症状。由于很难控制PLRV，所以世界各地的马铃薯有巨大的生产隐患。因此，有效地防治PLRV能够提高经济效益。采用常规的育种方法
36、培育抗马铃薯卷叶病毒品种是对人力、物力的一种极大的浪费，且稳定的抗性很难被维持住，无病毒的种薯也难避免再被感染。因此，至今对PLRV仍束手无策。PLRV 是单链正链RNA，在寄主细胞内PLRV先转录成负链 RNA，再以负链 RNA 为模板合成病毒正链 RNA。杨静华等(1998)根据PLRV的繁殖特点，设想在马铃薯体内转入切割PLRV复制酶基因负链的核酶序列，利用核酶切割PLRV 复制酶基因负链，中断PLRV复制酶基因的合成，从而在马铃薯体内PLRV的复制和表达得到阻止，最后达到抗 PLRV 的目的34。以这个设想为依据，设计、合成并克隆了马铃薯卷叶病毒中国分离株(PLRV-Ch)复制酶基因负
37、链 RNA 的核酶序列，位于 PLRV-S 序列的第3293-3295位核苷酸处是核酶的最佳切割位点34。根据这一结果设计了一个具有切割活性的锤头状核酶，其5端配对长度为10个核苷酸，3端为12个核苷酸35。体外实验表明，核酶RNA能够特异性切割PLRV-Ch复制酶基因负链RNA。番木瓜环斑病(Papaya ringspot virus disease)是热带和亚热带地区限制番木瓜生产的一种重要病害。引起病害的番木瓜环斑病毒 (Papaya ringspot virus，PRv)是马铃薯Y病毒组的主要成员之一，是由单链正链 RNA 构成的36。为了防治此病人们已经尝试过用了许多种方法和措施，但
38、结果都不显著。近年来，研究核酶进行抗病毒作用已成为新的热点。赵志英等(1998)通过基因工程手段将切割PRv RNA的核酶基因转入番木瓜。分子鉴定表明，该手段已成功获得转基因植株；进一步的攻毒试验表明，转基因番木瓜对PRv具有一定的抗性36。这是在杨建华等27之后，又一将核酶基因转入植物并成功获得抗性植株的实例。3.6其它作用核酶还用于切割流感病毒(The fiu virus)、鸭肝炎病毒(Duck heppatitis b virus)、鼠白血病病毒(Mouse leukemia virus)、淋巴细胞脉络丛脑炎病毒(Lymphocytes venation from encephaliti
39、s virus)等。结论 通常情况下，序列相同的核酸的两个RNA分子应该有大致相同的功能及结构，但结果却并不是这样。科学杂志在2000年这样报道：同一RNA序列有个相反的功能37。研究人员采用了两个具有活性的HDV核酶，一个是具有剪切活性，另一个则是通过试管进化后具有连接酶活性，虽然两个序列相同，但生物作用机制却完全不同。进一步研究表明他们空间结构的差异，可能是造成该生物功能相反的根本原因。因此Schultes和BarteI提出“内插片段”理论。为了验证他们的理论，他们采用突变的方法，改变HDV核酶的配对区域，如果空间结构为型的连接核酶则其连接速度将会提高750倍，如果为DHDV核酶，则剪切速
40、度将会提高70倍。此外，人们也发现核酶也有毒性作用，Levitz R在研究抗HIV-1的tat区域核酶时，采用的是锤头状核酶，由mRNA文库中筛选出合适的靶位点，在研究中发现该核酶抑制细胞生长等方面具有明显的细胞毒性作用38。目前核酶的体内研究已经向前迈了一大步，但要使核酶真正应用于人类疾病的防治中，仍需要更加深入的研究已得到更多的信息。尽管抗HIV核酶进行了I期临床试验研究，但是仍需要人们坚持不懈的探索。相信随着对基因治疗的进一步深入研究，核酶应用于临床是可以预见的。致谢历时两个月，从论文选题到搜集资料，从开题报告、写初稿到反复修改，期间经历了喜悦、聒噪、痛苦和彷徨，在写作论文的过程中心情是
41、如此复杂。如今，伴随着这篇毕业论文的最终成稿，复杂的心情烟消云散，自己甚至还有一点成就感。首先，要真诚感谢我的导师李红明老师，在几个月的时间里通过老师的耐心细致的指导下，不仅拓宽了我的专业知识面，提高了我的专业知识水平。老师渊博的学识、严谨的治学态度和缜密的思维使我受益良多。在此对导师的严格要求、言传身教和精心指导以及为学生倾注的大量心血表示最衷心的感谢！其次，在论文的完成过程中，得到了同小组同学的大力协助，在此表示诚挚的谢意。最后还要感谢同宿舍的各位室友们，谢谢你们的陪伴监督和为我在写论文过程中提供的优越条件。再一次真诚的感谢所有给予我关心和帮助的老师和朋友们！其次，我要感谢四年的大学生活，
42、感谢大学期间的所有老师同学以及我的家人和那些永远也不能忘记的朋友，他们的支持与鼓励，是我永远的财富。最后毕业论文的这段时间是我学生生涯中最有价值的一段时光。这里有治学严谨而不失亲切的老师，有互相帮助的同学，更有向上、融洽的学校生活氛围。借此论文之际，我想向所有人表示我的谢意。参考文献1 Czubayko F.Schulte AM,Berchem GJ.et al. Melanoma angiogenesis and metastasis modulated by ribozyme targeting of the secreted growth factor pleiotrophin J.Pr
43、or Natl Acad Sci USA,1996,93(25):14753-14758.2 Pavoc PA,Bouhana KS,Gallegos AM,et al.Antitumor and antimetastatic activity of ribozymes targeting the messenger RNA vascular endothelial growth factor receptorsJ.Clin Canceer Res,2000,6(3):2094-2103.3 洪卫国，王福生. 核酶抗肿瘤的基因治疗研究进展J. 国外医学肿瘤学分册，2000，27（6）：368-
44、370.4 屈艺，刘菽秋，彭文珍，等.人端粒酶逆转录酶核酶抑制端粒酶活性J.生物化学与生物物理学报，2002，34(3)：323-328.5 Irie A，Anderegg B，Kashani Sabet M，et a1Therapeutic efficacy of an adenovirus- m ediated anti-H-ras ribozyme in experimental bladder cancerJAntisense Nucleic Acid Drug Dev，1999，9 (4 ):341-349.6 Tsuchida T，Kijima H，HoriS，et a1.Aden
45、ovirus-mediated anti- K- ras ribozyme in duces apo ptosis and growth suppression of human pancreatic carcinomaJCancer Gene Ther，2000，7(3):373-383.7 Kijima H，Scanlon KJ. Ribozyme as an approach for growth suppression of human pancreatic cancerJMol Biotechnol，2000，14(1):59-728 张亚安，Nemunaitis J，童安伟针对KA酶定向突变人的肺癌细胞J.Mol Biotechnol，2000，15(1):39-499 孔心涓，林菊生. 核酶在
