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1、癌症高表达蛋白在肝细胞肝癌中的表达及意义癌症高表达蛋白在肝细胞肝癌中的表达及意义作者：张鹏 李卫华, 杨涛, 党军强, 陈勇【关键词】 ,癌症高表达蛋白;,肝细胞肝癌;,细胞周期摘 要 目的: 研究癌症高表达蛋白(Hec1)在原发性肝细胞肝癌(HCC)中的表达和意义。方法: 采用免疫组化SP 法检测27例正常肝组织、 30例癌旁组织及62例HCC组织中Hec1的表达; 用Western blot检测上述组织中Hec1蛋白的表达。结果: 在正常肝、 癌旁组织及HCC组织中, Hec1蛋白的阳性表达率分别为0%、 20.8%、 62.9%, 各组织中Hec1蛋白的表达差异均有统计学意义(P0.05
2、)。Hec1蛋白的表达与HCC的Edmondson分级、 侵袭转移显着相关。Western blot结果表明, 在正常肝、 癌旁组织及HCC组织中, Hec1蛋白的平均表达量的分别为0、 0.0.03、 0.890.16, 差异有统计学意义(P0.05)。结论: Hec1蛋白的过度表达可能在HCC的发生和发展中起重要作用。关键词 癌症高表达蛋白; 肝细胞肝癌; 细胞周期 待添加的隐藏文字内容1原发性肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是我国常见肿瘤之一, 在我国该病的发病率有上升趋势。癌症高表达蛋白(highlyexpressedincancer, Hec1
3、)最初是通过酵母双杂交方法发现的, 由于在癌症中表达高于正常组织而被命名。Hec1蛋白属于细胞周期蛋白, 在终末分化的细胞中不表达, 在所有分裂旺盛的细胞中表达量高。我们应用免疫组化和Western blot技术检测Hec1蛋白在HCC组织的表达, 探讨Hec1蛋白与HCC侵袭和转移的关系。1 材料和方法1.1 材料 收集2005-042006-06第四军医大学西京医院手术切除的HCC标本62 例。年龄3276（平均56）岁。按照Edmondson分级标准级为高分化癌20 例, 级为低分化癌42 例。患者肝功能按Child 分级, A 级35 例, B 级27 例。直径5 cm的肿瘤24 例,
4、 直径5 cm的肿瘤38例。HCC侵袭转移条件为: 肝门淋巴结转移; 肝内肿瘤数目2 个; 门静脉癌栓形成; 癌周多个卫星结节形成; 癌组织浸润破坏肿瘤包膜。凡符合上述条件中的1 项以上者定为有转移倾向组, 共41例, 凡不符合上述5 项条件者为无转移倾向组, 共21 例。癌旁组织标本24 例。20例正常肝组织取自肝血管瘤手术切除标本作为对照组。手术中取材后均分成2 份: 1 份经100 mL/L甲醛固定, 石蜡包埋, 连续4 m切片; 1份置液氮速冻后于-70低温冰箱保存。所有标本均经病理组织学检查证实。鼠抗人Hec1单克隆抗体(mAb)为中国科技大学生命科学院姚雪彪教授提供, 羊抗鼠(二抗
5、)、 SP试剂盒购自北京中山公司。ECL发光液为Pierce公司产品。GAPDH(抗3磷酸甘油醛脱氢酶, mAb)标准内参照为上海康成生物公司产品。Triton X100、 二硫苏糖醇(DTT)、 PMSF、 Aprotinin为Sigma公司产品, 其余试剂为国产分析纯。1.2 方法1.2.1 免疫组化染色 采用链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶(SP)免疫组织化学方法, 具体操作按试剂说明书进行。以微波枸橼酸盐进行抗原修复, DAB显色, 同时用PBS代替一抗作阴性对照, 用预实验中已知的Hec1表达阳性片作阳性对照。结果判断: Hec1以细胞核染成淡黄或棕黄色为阳性, 在400倍光镜下观察20
6、个视野, 每个视野计数200个细胞, 阳性细胞数记分: 5%为0分, 5%25%为1分, 26%50%为2分, 51%75%为3分, 75%为4分; 染色强度记分: 淡黄色为1分, 黄色为2分, 棕黄色为3分; 组织化学积分(两记分的乘积): 1为阳性, 1为阴性。1.2.2 Western blot检测 按15（质量/体积）的比例加入组织裂解液, 含7 mmol/L尿素, 20 mL/L Triton X100, 40 mmol/L TrisHC1, pH8.0, 100mg/L PMSF, 1mg/L Aprotinin, 40mmol/L DTT和去离子水, 置于冰上, 将组织碾碎后放置
7、1.52.0 h, 匀浆器匀浆; 4,000 r/min离心20 min, 取上清匀浆用Bradford法测定上清液中总蛋白的浓度, 分装于-70冰箱备用。将总蛋白煮沸变性10 min, 以50 g/孔上样, 在0 g/L的SDSPAGE 凝胶中进行电泳分离, 电泳完毕后, 通过电转移法将蛋白质从SDSPAGE凝胶转移至PVDF膜。TBST洗涤后PVDF膜在含50 g/L脱脂奶粉的TBST中37封闭90 min, 加入一抗(鼠抗人Hec1抗体, 稀释度11000)4孵育过夜, TBST 充分漂洗(10 min3次), 加入二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG, 稀释度11000) 37作用1 h, TBST 充分漂洗(10 min3次)后, 化学荧光法(ECL)显色, 结果用凝胶成像仪扫描, 用软件分析。以待测蛋白Hec1条带与内参照GAPDH 条带灰度值的比值作为指标。1.2.3 统计学处理 采用SPSS10.0 软件对数据资料进行分析。组间率的比较采用2检验, Fisher确切概率法。Western blot结果比较采用单因素方差分析。
