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1、稳定表达PTEN、EGFR、EGFRv人恶性胶质瘤细胞系的建立及其分析鉴定稳定表达 PTEN、EGFR、EGFRv人恶性胶质瘤细胞系的建立及其分析鉴定#董裕翠，任欢*51015（哈尔滨医科大学免疫教研室，哈尔滨 150081）摘要：目的：分别建立稳定表达抑癌基因 PTEN、表皮生长因子受体（EGFR）及突变型 EGFRv的恶性胶质瘤细胞系，从基因、蛋白及细胞水平验证外源性 PTEN、EGFR 和 EGFRv基因对 U87MG 细胞的影响。方法：采用 PCR 方法扩增 PTEN 基因编码区序列，构建重组表达载体 pcDNA3.1 - /PTEN。分别将 pcDNA3.1 - /PTEN 和 pL
2、WERNL 转染 U87MG 细胞，筛选后建立稳定细胞系。应用 RT-PCR 和 Western blotting 法检测 PTEN、EGFR 在不同抗性细胞克隆的表达。MTT 法检测外源性 PTEN、EGFR 和 EGFRv基因对细胞增殖的影响。结果 ： 构 建 真 核 表 达 载 体 pcDNA3.1 - /PTEN 及 稳 定 表 达 细 胞 系 U87MG-PTEN 和U87MG-EGFR，并经 RT-PCR 及 western blotting 验证。转染外源性 PTEN 抑制细胞增殖（P 0.05），转染 EGFRv促进细胞增殖（P 0.05），转染 EGFR 对细胞增殖无显著影响
3、（P 0.05）。结论：成功建立稳定表达抑癌基因 PTEN、原癌基因 EGFR 及其突变体 EGFRv的人恶性胶质瘤细胞系。为进一步研究所转染基因对相关下游细胞信号转导通路的影响及对恶性胶质瘤发生发展的作用打下良好基础。关键词：恶性胶质瘤；PTEN 基因；EGFR 基因；EGFRv基因；稳定转染中图分类号：R20Establishment and Identification of Human GlioblastomaCell Line Stably expressing PTEN/EGFR /EGFRvDong Yucui, Ren Huan Department of Immunology
4、, Harbin Medical University, Harbin 150081 25303540Abstract: Objective：To establish human glioblastoma cell line U87MG-PTEN, U87MG-EGFRand U87MG-EGFR stably expressing PTEN, epidermal growth factor receptor EGFR andEGFRv, respectively. On gene expression, protein expression and cell proliferation le
5、vels toverify the effect of exogenous PTEN, EGFR and EGFRv gene on the U87MG cells. Methods：The PTEN gene CDS was amplified by PCR , then inserted into eukaryotic expression vectorpcDNA3.1 - to construct recombinant vector pcDNA3.1 - /PTEN. pcDNA3.1 - /PTEN andpLWERNL were transfected into U87MG cel
6、ls respectively. The expression of PTEN and EGFRin different G418 resistant cell clones was detected by RT-PCR and Western blotting. The effectof exogenous PTEN, EGFR and EGFRv gene on the cell proliferation was tested by MTTassay. Results：The eukaryotic expression vector pcDNA3.1 - /PTEN was constr
7、ucted. The stablecell lines U87MG-PTEN and U87MG-EGFR were established and verified by RT-PCR andWestern blotting. Stable expression of exogenous PTEN can suppress the growth of humanglioblastoma cell line U87MG P 0.05 , stable expression of exogenous EGFRv can increasethe growth of U87MG P 0.05 , w
8、hereas stable expression of EGFR has much less effect on theU87MG cells growth P 0.05 . Conclusion ： We have successfully established humanglioblastoma cell line U87MG-PTEN, U87MG-EGFR and U87MG-EGFR stably expressingPTEN, EGFR and EGFRv, respectively. This will lay down a good basis to further stud
9、y theeffect of transfected gene on the related downstream signaling pathways in glioblastoma and thedevelopment of GBM.Keywords: Glioblastoma; PTEN gene; EGFR gene; EGFRv gene; stable transfect基金项目：本课题受高等学校博士学科点专项科研基金资助（项目编号 20092307110006）作者简介：董裕翠， 1982- ，女，讲师，主要研究恶性脑胶质瘤信号转导模式及靶向治疗。通信联系人：任欢， 1967-
10、，女，教授，主要研究恶性肿瘤的靶向治疗及免疫逃逸机制。E-mail:huanren2009126-1-4550556065707580在恶性胶质瘤中，表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）的过表达及突变占 45%1。EGFR 基因扩增常伴随结构的变异，其中第三类突变体（EGFRv）是恶性胶质瘤中最常见的基因组突变体，该受体缺失 2-7 外显子。抑癌基因 PTEN（humanphosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten）在正常情况下通过调控原癌基因磷脂酰肌醇（PI）-3-激
11、酶（PI3K）来抑制该信号通路的活化从而发挥调节功能。恶性胶质瘤中 36% 的 PTEN 基因发生了缺失或突变1 。研究证实，EGFR、PTEN 等基因的异常表达正是促进与之相关信号转导通路网络异常活跃的重要因素。因此，EGFR 下游区域密切相关的细胞信号转导网络可能是在维持恶性胶质瘤细胞基因表型及功能状态中起关键作用的主效通路。人恶性胶质瘤细胞U87MG表达低水平EGFR基因，不表达EGFRv基因，PTEN基因发生剪接位点突变，第3外显子缺失，因而不能发挥其功能。本实验将建立分别表达PTEN和EGFR的两种人恶性胶质瘤细胞系，研究外源性PTEN、EGFR和EGFRv基因的表达及对U87MG细
12、胞增殖的影响。1 材料与方法1.1 主要材料人恶性胶质瘤细胞 U87MG、LN229 和 U87MG-EGFRv为本教研室保存，质粒载体pcDNA3.1 - 由本校遗传学教研室馈赠，含 EGFR 基因的表达载体 pLWERNL 由 Dr. FrankFurnari Ludwig Institute, San Diego, CA 惠赠，LipofectamineTM2000 购自 Invitrogen 公司，DNA marker、限制性内切酶（EcoR、Kpn、Sal和 Nco）购自 TaKaRa 公司，T4 DNA连接酶购自 NEB 公司，G418 为 EMD Biosciences 公司产品
13、，EGFR 兔单克隆抗体、PTEN兔单克隆抗体、HRP 标记抗兔抗体购自 Cell Signaling 公司，-actin 一抗购自武汉博士德公司，四甲基偶氮唑蓝 MTT 为 Sigma 公司产品。1.2 重组质粒 pcDNA3.1 - /PTEN 的构建0. 引物设计根据 GeneBank 中 PTEN 的 cDNA 序列，分别在引物 5端加上 EcoR和 Kpn酶切位点，设计引物 P1（上游引物: CCG GAA TTC GGC TCC CAG ACA TGA CAG，下游引物: CGGGGT ACC AAG TTT ATT TTC ATG GTG TTT），用于扩增 PTEN 基因编码区
14、。根据包含PTEN 基因第三外显子的原则设计引物 P2（上游引物：CAT GAC AGC CAT CAT CAA AG，下游引物：GTC AAG ATC TTC ACA AAA GG），用于检测突变型和野生型 PTEN 的表达。根据 GeneBank中 EGFR cDNA 序列，设计引物 P3（上游引物: CTT CGG GGA GCA GCG ATGCGA C，下游引物：ACC AAT ACC TAT TCC GTT ACA C），检测 EGFR 基因的表达。根据 GeneBank 中 -actin cDNA 序列，设计参照引物 P4（上游引物：ATT GGC AAT GAG CGGTTC
15、CGC，下游引物：CTC CTG CTT GCT GAT CCA CAT C）。引物由上海英俊生物技术公司合成。. 人 PTEN cDNA 的扩增按 Trizol 试剂说明书提取 LN229 细胞（LN229 中含完整的 PTEN 基因，能表达内源性的 PTEN 蛋白2,3 5min。以 LN229 cDNA 为模板，P1 为引物，扩增 PTEN 编码区序列。反应条件: 98变-2-性 10s，65退火 10s，72延伸 70s（30 个循环）。PCR 产物通过 1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。85. 人 PTEN 真核表达载体的构建将回收纯化的 PCR 产物及质粒 pcDNA3. 1 - 分别用
16、 EcoR和 Kpn双酶切，低熔点琼脂糖电泳分离、胶回收纯化后，经 T4 DNA 连接酶连接，转化大肠杆菌 TOP10 感受态细胞，重组质粒分别经 Sal和 Nco酶切及基因测序鉴定。.G418 对 U87MG 细胞的毒性试验9095U87MG 在 5% CO2、37条件下培养于 DMEM 培养基（含 10%胎牛血清、100U/ml 青霉素和 100g/ml 链霉素）。取生长状态良好的细胞制成单细胞悬液，接种于 6 孔板中，待细胞贴壁后，更换含有 G418 的浓度分别为 100、200、300、400、500、600、700、800、900和 1000g/ml DMEM 培养基，每种浓度设 2
17、 个平行孔，每隔 3 天换药 1 次，以 10-14 天细胞全部死亡的最低 G418 浓度为最佳筛选浓度。1.3 稳定转染细胞系的建立按照 LipofectamineTM2000 操作说明书，用表达载体 pcDNA3.1 - /PTEN 和 pLWERNL分别转染 U87MG 细胞。转染约 48 小时后，在含 G418 的选择性培养基中筛选细胞 2-3 周，获得抗性细胞克隆，扩增培养、鉴定后，建立稳定细胞系。1.4 稳定细胞系的鉴定100.RT-PCR 法分别收集 pcDNA3.1 - /PTEN 和 pLWERNL 转染后挑取的细胞克隆，按 Trizol 试剂说明书提取细胞总 RNA，取 1
18、g 进行反转录。以 P2 为引物的 PCR 反应条件：94预变性 3min，94变性 30s，58退火 30s，72延伸 45s（30 个循环），72延伸 10min。以 P3 为引物的 PCR 反应条件：94预变性 2min，94变性 30s，58退火 30s，72延伸 60s（30 个循105110115环），72延伸 10min。以 P4 为引物的 PCR 反应条件：98变性 10s，54退火 15s，72延伸 30s（28 个循环）。取 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。. Western Blotting 法分别收集 pcDNA3.1 - /PTEN 和 pLWERNL 转染后挑取
19、的细胞克隆，经裂解液裂解细胞，Bradford 法测蛋白浓度。样品于 100 水浴 5 min ,取等量蛋白上样进行 SDAS - PAGE 电泳,电泳后将蛋白转移至硝酸纤维膜上,5 %脱脂奶粉封闭,随后与特异性一抗孵育 4过夜，次日与辣根过氧化物酶 HRP 标记的二抗室温孵育 1 小时后，暗室中用 ECL 化学发光试剂作用杂交膜显影成像于 X 胶片上。1.5 细胞增殖实验分别取对数生长期 U87MG、U87MG-PTEN、U87MG-EGFR 和 U87MG-EGFRv细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，按每孔 4103 个细胞接种于 96 孔板中，每孔体积 100L。用含 10%胎牛血清的培养
20、液培养 24 小时后，更换无血清培养液。以 U87MG 为对照组，U87MG-PTEN、 U87MG-EGFR 和 U87MG-EGFRv为试验组，每组细胞设 4 个复孔，6 个时间检测点，分别于第 1、2、3、4、5、6 天检测。在指定时间点每孔加入 MTT 5mg/ml 20l，37孵育 4h 后吸弃孔内培养基，每孔加入 DMSO 100l，室温振荡 10min，在酶联免疫检测-3-120125130仪 490nm 波长下测定其吸光度值，以细胞增殖百分率为纵坐标、时间为横坐标绘制细胞生长曲线图。1.6 统计学方法本实验数据以均数标准差（ X S）表示，采用 SPSS 软件包进行统计学处理，
21、组间样本均数比较采用方差分析，以 P 0.05 作为有无显著性差异的判断标准。2 结果2.1 重组质粒的鉴定重组质粒 pcDNA3.1 - /PTEN，经 Sal酶切可得到长度 4480bp 和 2185bp 两条片段，经Nco酶切可得到长度 3342bp、2588bp 和 735bp 三条片段，与预期片段一致（图 1）。经基因测序、BLAST 比对，重组质粒的插入片段序列与 GenBank 数据库中 PTEN 编码区序列相符。图1 pcDNA3.1 - /PTEN酶切鉴定结果Fig.1 Restrictive endonuclease digestion of pcDNA3.1 - /PTE
22、N1352.2M:DNA marker 1: Sal酶切质粒 2: Nco酶切质粒G418 最佳筛选浓度的确定800、900、1000g/ml 组于第 2 天， 500、600、700g/ml 组于第 3 天，300、400g/ml组于第 5 天开始出现抑制细胞生长现象，第 10 天，除 200、300g/ml 组有细胞存活外，其余各组细胞全部死亡。因此，可以认为在本实验条件下 G418 最佳筛选浓度为 400g/ml。1402.3 稳定细胞系的鉴定.RT-PCR 水平.（1）：用引物 P2 进行 PCR 扩增，在转染 pcDNA3.1 - /PTEN 的三株细胞克隆中可扩增出两条条带，即突变
23、型 PTEN（283bp）和野生型 PTEN（328bp），而在 U87MG 细胞只能检测到突变型 PTEN（283bp）的表达（图 2）。下图为相对应细胞内参照基因 -actin145（336bp）的表达。-4-图2 RT-PCR检测PTEN mRNA的稳定表达Fig.2 RT-PCR analysis of PTEN mRNA stable expressionM: DNA marker 1: U87MG细胞2：转染pcDNA3.1 - /PTEN的9号克隆1503: 转染pcDNA3.1 - /PTEN的10号克隆4: 转染pcDNA3.1 - /PTEN的14号克隆.（2）：以 P3
24、为引物，进行 PCR 扩增，在 U87MG 和 pLWERNL 转染的 U87MG细胞 9 号克隆中可扩增出 EGFR 的条带（1044bp），且转染 pLWERNL 的细胞中 EGFR 基因表达更强（图 3）。下图为相对应细胞中内参照基因 -actin（336bp）的表达。155图3 RT-PCR检测EGFR mRNA的稳定表达Fig.3 RT-PCR analysis of EGFR mRNA stable expressionM:代表DNA marker 1: U87MG细胞2: 转染pLWERNL的U87MG细胞9号克隆160165. Western Blotting 水平检测. 1
25、图 4 结果显示，转染 pcDNA3.1 - /PTEN 的三株细胞克隆（9 号，10 号和 14 号）表达 PTEN 蛋白（54kDa），这表明 PTEN 在此三株细胞克隆中得到了稳定表达，且 14 号的蛋白表达最强，故将其建立稳定细胞系，即为 U87MG-PTEN。图4 Western Blotting检测PTEN蛋白的稳定表达Fig.4 Western Blotting analysis of PTEN protein stable expression1:U87MG细胞2：转染pcDNA3.1 - /PTEN的9号克隆3: 转染pcDNA3.1 - /PTEN的10号克隆 4: 转染p
26、cDNA3.1 - /PTEN的14号克隆-5-. 2 图 5 结果表明，转染 pLWERNL 的 U87MG 细胞 9 号克隆表达 EGFR 蛋白170175180（170kDa），而在 U87MG 细胞和其余转染 pLWERNL 后所挑取的细胞克隆中均没有检测到 EGFR 蛋白的表达，这表明 EGFR 蛋白在 9 号克隆中得到了稳定表达，故将其建立稳定细胞系，即为 U87MG-EGFR。图5 Western Blotting检测EGFR蛋白的稳定表达Fig.5 Western Blotting analysis of EGFR protein stable expression1: U87
27、MG 细胞 2: 转染pLWERNL的U87MG细胞9号克隆2.4 细胞增殖实验各组细胞生长曲线见图 6。统计学分析表明，在无血清状态下培养 6 天后，试验组细胞U87MG-PTEN、U87MG-EGFRv与对照组细胞 U87MG 相比，吸光度值都有显著性差异（P 0.05）；而试验组细胞 U87MG-EGFR 与对照组细胞 U87MG 相比，吸光度值无显著性差异（P 0.05）。这表明在无血清状态下，外源性 PTEN 的表达能抑制 U87MG 细胞的增殖，EGFRv能促进 U87MG 细胞的增殖，而野生型 EGFR 对 U87MG 细胞增殖影响不显著。185Fig.6图6 各组细胞生长曲线图
28、cell proliferation under serumfree conditions3 讨论抑癌基因 PTEN 和原癌基因 EGFR 功能状态及其基因变异方式与恶性胶质瘤的发生发展190195等生物学行为有密切关系，并且影响胶质瘤的临床治疗效果和预后判定。PTEN 基因编码的蛋白质具有双特异性蛋白/脂质磷酸酶活性4，在诱导细胞周期阻滞和凋亡以及细胞的粘附、迁移、分化等多方面均起到了至关重要的作用5-7。研究表明，外源性 PTEN 在 PTEN 突变的恶性胶质瘤细胞中的表达，可诱导 G1 期阻滞，有效抑制肿瘤细胞生长。在恶性胶质瘤发生和发展过程中, EGFR 常常出现基因扩增和重排，导致基
29、因突变使肿瘤细胞表面的抗原表型发生变化，其中最常见的突变类型为 EGFRv，其激活表现为配体非依赖性酪氨酸激酶组成性激活8。到目前为止，EGFRv在将近 61 %恶性胶质瘤被检测到，而在多种正常组织中未检测到。许多研究表明，EGFRv能促进细胞增殖，抑制细胞凋-6-亡，提高肿瘤细胞致瘤性9，EGFRvIII 还能提高细胞活力，促进肿瘤细胞的迁移和侵袭10。因其只在肿瘤细胞中表达,而在正常细胞中不表达,具有肿瘤特异性,而成为肿瘤靶向治疗的200205210215220225230235热点。在本研究中，将重组真核表达载体 pcDNA3.1 - /PTEN 和 pLWERNL 分别转染人恶性胶质瘤
30、细胞 U87MG，从基因和蛋白两个水平验证了转染基因的稳定表达，分别建立了稳定表达外源性 PTEN、EGFR 基因的细胞系 U87MG-PTEN 和 U87MG-EGFR，并就外源性 PTEN、EGFR 和 EGFRv基因对细胞增殖的影响进行了研究。MTT 实验 表明，PTEN 能抑制U87MG 细胞的增殖，EGFRvIII 能促进 U87MG 细胞的增殖，而 EGFR 对 U87MG 细胞增殖影响不显著。稳定细胞系 U87MG-PTEN、U87MG-EGFR 和 U87MG-EGFRv的成功构建为进一步研究所转染基因 PTEN、EGFR 和 EGFRv对相关下游细胞信号转导通路的影响及对恶性
31、胶质瘤发生发展的作用打下良好的基础，从而明确胶质瘤中不同分子亚型的细胞下游相关信号转导通路的差别，有助于正确区分不同分子亚型不同作用靶点，提出有效的、有针对性的治疗靶点，为临床应用提供理论依据。4 结论本研究成功建立稳定表达抑癌基因 PTEN、原癌基因 EGFR 及其突变体 EGFRv的人恶性胶质瘤细胞系。这为进一步研究所转染基因对相关下游细胞信号转导通路的影响及对恶性胶质瘤发生发展的作用提供了良好的体外实验模型。参考文献 References 1 The Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic character
32、ization defines humanglioblastoma genes and core pathways J.nature, 2008,455 7216 :1061-1068.2 Li J, Yen C, Liaw D, et al. PTEN, a putative protein tyrosine phosphatase gene mutated in human brain, breast,and prostate cancerJ. Science, 1997, 275 5308 :1943-1947.3 Furnari FB, Lin H, Huang HS, et al.
33、Growth suppression of glioma cells by PTEN requires a functionalphosphatase catalytic domainJ. Proc Natl Acad Sci U S A, 1997, 94 23 :12479-12484.4 Myers MP, Stolarov JP, Eng C, et al. P-TEN, the tumor suppressor from human chromosome 10q23, is adual-specificity phosphataseJ. Proc Natl Acad Sci U S
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