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1、诱导多能干细胞（iPSCs）研究现状与前景展望刘兴夏* 肖羽恒* 张峰伟*（*桂林医学院12级临床3班）联系方式：13788573975诱导多能干细胞（iPSCs）研究现状与前景展望刘兴夏* 肖羽恒* 张峰伟*（*桂林医学院12级临床3班）【摘 要】本文介绍了干细胞基础研究领域的最新成果和研究趋势, 对人类可诱导的多能干（induced pluripotent stem, iPS）细胞的基础研究和临床应用研究进行综述；运用文献计量学方法对近年诱导多能干细胞研究的相关文献进行分析,比较国内外诱导多能干细胞研究水平的差距.【关键字】诱导多能干细胞(iPSCs); ESCs;重编程;文献计量学;研究
2、现状2006年, 日本京都大学Yamanaka (山中伸弥)教授所率领的研究小组筛选出了4个在胚胎干细胞或肿瘤细胞中高表达的基因转录因子(Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc, OSKM), 并利用逆转录病毒载体将这些因子转染到小鼠成纤维细胞中1。通过这些因子在受体细胞内过量表达, 诱导成纤维细胞去分化, 使成体细胞重编程为多能干细胞, 并将其定义为诱导多能干细胞 (Induced pluripotent stem cells, iPSCs)。iPS细胞的主要特征表现为：能够形成ESC细胞样的集落, 胞核较大核质比高, 碱性磷酸酶(AP)染色呈阳性, 表达内源性Oct4、Sox2和Nano
3、g, 端粒酶活性提高, 能在裸鼠体内形成畸胎瘤等2。经基因芯片分析, iPS细胞的基因表达图谱与胚胎干细胞(ESCs)相类似, 而与诱导之前的受体细胞明显不同3。iPSCs技术的诞生是跨时代的成果, Shinya Yamanaka因为这项开创性的实验荣获2012年诺贝尔生理学或医学奖。1 iPSCs技术的发现有研究者4认为, 是三股研究潮流的融合, 导致了iPSCs 技术的诞生。第一股潮流是对核移植的重编程研究。1962年, John Gurdon报道了他堪称经典的实验室研究成果: 将未受精的卵转入成年蛙的小肠细胞核可以发育成蝌蚪5。三十多年后, Ian Wilmut及其同事报告了多莉羊的诞生
4、, 这是通过哺乳类上皮细胞的体细胞克隆产生的首个哺乳类动物6。这些体细胞克隆的成功证明了: 即使已经分化的细胞也含有整个生物体发育所需要的全部遗传信息, 卵母细胞含有可以重编程体细胞核的因子。第二股研究潮流是发现“ 主控的” 转录因子。1987年, 科学家证明哺乳动物转录因子MyoD能将成纤维细胞转换为肌细胞7。这些结果形成了“主控的调节因子”概念, 该转录因子决定并诱导细胞谱系的命运。第三股研究潮流涉及ESCs, 具有以上同样的重要性。自1981年第一代小鼠ESCs8建系之后, Aus-tin Smith 等确立了能够长期维持干细胞多能性的体外培养条件9。结合前两个研究潮流, 我们提出这样一
5、种假设: 卵母细胞或ESCs中存在一种多个因子的组合, 这种组合可以将体细胞重编程回到胚胎状态, 于是有人110设计实验来确定这种组合。2 iPSCs技术的成熟和理解2006年8月, 日本科学家Takahashi和Yamanaka率先在Cell上发表研究成果, 其小组利用Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4 这4种基因将小鼠成纤维细胞诱导为iPS细胞1.2007年11月, Yamanaka小组又利用Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4 4种基因将人皮肤成纤维细胞重编程为iPS细胞11.2.1重编程概述iPS 细胞和ES细胞功能类似, 且具有超越ES细胞的优势, iPS 细胞可以由体细胞
6、生成, 从而绕开了ES细胞研究一直面临的伦理和法律等诸多障碍。但科研人员长期受困于iPS细胞诱导效率低下、速度慢、组成复杂等障碍。对于体细胞重编程过程的具体细节至今仍知之甚少。细胞核重编程是指, 成熟的细胞由分化的状态被逆转到一种未分状态的过程12.细胞核的重编程现象最早是在核移植实验中被发现的13.然而, 体细胞核移植实验也具有很大的局限性: 克隆的效率极低; 产生的许多后代在各个阶段都体现出严重的发育异常; 由于需要使用卵母细胞, 人的核移植实验受到强烈的伦理学质疑.这些不足, 都制约了核移植技术的进一步发展和应用.其次, 将成熟的体细胞与多潜能的细胞 (ES细胞、胚胎癌细胞(EC细胞)
7、等) 融合1417, 或者用胚胎干细胞提取物来处理体细胞1819, 也可以在一定程度上使体细胞发生重编程.利用这两种方法, 可以实现某些多能性标志分子的重新表达和多种分化潜能的获得.但是这两种方法也有明显的弊端. 体细胞与多能性细胞的融合效率比较低, 融合之后的细胞具有两套染色体, 并且在移植后会发生排斥现象20.通过外源导入与多能性相关的转录因子来诱导体细胞核发生重编程, 从而使体细胞转变成多能性干细胞, 是一种具有很强创新性的研究方法, 这种新方法与上述几种方法相比, 相对简单, 摆脱了材料来源和伦理学的诸多限制, 重编程的效率和程度都十分可观, 因而该研究成果引起了生命科学领域一次巨大的
8、轰动.2.2 “初始化”之谜体细胞在外源转录因子的诱导下的重编程之后会被“初始化”到一种具有多种分化潜能的状态.由于何种因子启动了细胞重编程的程序, 随着研究的进展有多种不同的说法。Yamanaka1率先发现iPSCs时, Takahashi和Yamanaka从已报道的24个与多能性维持相关的候选基因中筛选出4个关键基因。在当时的条件下, 他们检测了4 种基因的不同组合方式能否产生iPS 细胞, 结果表明, 这4个基因中的任意2个或3个组合, 都无法形成具有ES细胞特性的iPS 细胞, 说明这4个基因缺一不可21. 这就是这4个关键基因( Oct4 , Sox2, c- Myc 和 Klf4)
9、 的发现过程. 在2009年以前, 除了Thomson 等人22利用自己的方法筛选出了另外一套基因组合之外, 几乎其他所有关于iPS 细胞的研究都采用Yamanaka 和Takahashi所采用的这4种基因21. 在诱导细胞的4个基因中, c-Myc是明确的癌基因, Klf4也被证实与肿瘤发生相关.通过改变筛选的基因, 获得了更接近ESCs的细胞。同时发现20%的转染细胞后代出现肿瘤, 以及逆转录病毒的不安全23。因此, Yamanaka 等24通过去除转染及药物筛选, 证实其他3个基因便可以使野生型小鼠及人细胞诱导成为iPS细胞, 从而避开了c-Myc过表达导致肿瘤的可能. 随后, Huan
10、gfu等25发现Oct4 和 Sox2 两个基因就可以诱导人成纤维细胞产生 iPS 细胞, 更进一步避开了 Klf4 导致肿瘤的可能性。Kim等2627证实, 单一向成年小鼠神经干细胞中导入Oct4 与 Sox2 两个基因, 甚至 Oct4 一个基因即可将其转化成 iPS 细胞. 目前比较一致的观点就是 c-Myc 启动了再编程的过程, 但在细胞向干细胞转变的过程中, 则是 Oct3/4、Sox2 和 Klf4 这3个基因的作用, 因此, c-Myc 在 iPS 的过程中并非必需的因子28。除了使用整合的逆转录病毒和慢病毒转染, 还有报道许多方法能够产生非整合的iPSCs 。这些方法包括质粒2
11、930、仙台病毒31、腺病毒32、合成RNA33和蛋白质34。此外, 也已经尝试由小分子诱导重编程。麻省总医院、哈佛干细胞研究所组成的一个国际研究小组, 在新研究中绘制出了体细胞重编程为iPS 细胞的分子线路图35.研究人员证实诱导多能性过程引起了两次转录波, 第一波是由c-Myc/Klf4 驱动, 第二波是由Oct4/Sox2/Klf4驱动。难以发生重编程的细胞激活了第一波, 但却无法启动第二转录波, 提高4个因子的表达则可以解决这一问题。此外, 研究人员发现, 在第一波后逐渐形成了一些双价基因(bivalent genes), 而在第二波后细胞获得稳定的多能性之时细胞才发生DNA甲基化改变
12、。研究人员还确定了在重编程过程中充当路障的基因, 以及细胞进一步富集从而使之更易于形成iPS 细胞的表面标记物.这些认识对于提高重编程的效率及其未来的治疗应用具有非常重要的意义.2.3 iPSCs的巨大优势2.3.1免疫原性有限iPSC来自患者自身的体细胞, 因此与ESCs相比较, 移植回患者体内可一定程度的避免机体的免疫排斥反应。为了广泛应用, 有必要提前建立一个储备库, 挑选来自健康志愿者或脐带血库的质量合格的iPSCs 克隆。HLA纯合子捐助者产生的iPSCs 能显著降低免疫排斥35最近的研究来自日本的科学家, 他们利用小鼠iPS 细胞生成了皮肤和骨髓, 并将它们移植到基因相同的小鼠体内
13、, 证实不会引发强烈的免疫反应36.研究结果发表在Nature杂志上,应该可以消除人们对iPS 细胞的一些疑虑.有报道整理说37, 日本国立放射学研究所的Masumi Abe研究小组用将iPS 细胞或ES细胞与小鼠胚胎相融合, 随后小鼠胚胎发育形成了包含各种细胞类型的嵌合子小鼠。然后, 他们将来自这些动物的皮肤移植到基因相同的小鼠身上。来自两组的移植物在2 个月后仍然如前, 表明iPS 细胞和ES细胞一样, 触发的免疫反应极其微小。骨髓移植物显示出同样的情形。不论是来自iPS 细胞是ES细胞, 它们同样能很好地存活, 让遭受致命辐射的小鼠的骨髓获得重建。实验中没有观察到对iPS 细胞或ES细胞
14、衍生的组织的免疫反应, 包括T细胞浸润、退化皮肤和畸胎瘤的组织中免疫原性引起的ZG16和Hormad1 基因也没有增加。研究结果表明, iPS 细胞与ES细胞分化的移植细胞的免疫原性有限。但有限的免疫原性, 不代表没有. 有报道说非转基因的iPSCs 具有弱免疫反应, 这个问题是否重要38目前尚不清楚, 因为最突出的研究报道了被检查的未分化iPSCs 具有免疫原性39, 当然这种细胞绝不会被用于细胞移植治疗。我们必须了解所有这些结果, 并综合考虑全面认识iPSCs。2.3.2避开伦理争议胚胎干细胞有以下几个来源:从发育良好的囊胚中分离内细胞群细胞。从5 9周的胚胎生殖腺中分离胚胎干细胞。利用克
15、隆技术( 治疗性克隆) 获得。即将体细胞核移植到去核卵母细胞中, 使之发育成囊胚, 再分离其内细胞群细胞40。无论是何种来源, 都必须破坏胚胎的完整性, 等于说是杀死了一个“有潜力的生命”, 因此ESCs的研究引发了宗教界和保守人士的强烈质疑。iPSCs的制造不需要利用胚胎,并且它拥有与ESCs功能很相近的多向分化能力。尽管它们的起源和生成方法不同, 人造细胞和天然存在的细胞之间存在如此相似性, 绝无仅有。如神经细胞和心肌细胞这些体细胞已经可从ESCs/iPSCs 产生, 或直接从成纤维细胞产生。iPSCs技术一经问世, 就被很多科学家和媒体评价其未来将在生命科学和医学研究领域里发挥ESCs所
16、不能达到的效果。3诱导多能性的安全性尽管现在的技术已经可以剔除诱导因子中的癌基因,并使用安全性较好的载体, 但iPSCs依然被认为有潜在异常。有些报告认为, 除了基因表达变异、DNA甲基化和多能性的潜力外, iPSCs还有其他的潜在异常, 包括体细胞突变、拷贝数变异和免疫原性。在这些报告中, 在Yamanaka看来10, iPSCs的负面影响被夸大了。Yamanaka认为媒体的反应过度, 随之而来的科学评论标题也耸人听闻, 如“黑暗的一面”、“受到攻击”、“漏洞”、“麻烦”和“成长中的烦恼”等。然而, 尽管有这些负面新闻, 随后的分析表明, 许多iPSCs 内发现的遗传差异似乎早已存在于原始的
17、体细胞中, 因此, 与重编程过程本身无关10。另一项研究显示, 一组能够产生all-iPSCs 小鼠的iPSCs 克隆, 相对于它们的亲本细胞来说其遗传改变极小41。没有转Myc基因的iPSCs 所产生的嵌合体小鼠及其后代显示生理正常, 表明这些iPSCs 不含有对功能有负面影响的有害遗传改变42-43。每种诱导方法会产生多个质量不同的iPSCs 克隆。因此, 临床应用时必须优选克隆。我们必须确认其体外分化倾向、基因组及表观基因组的完整性。4 iPSCs技术应用研究进展4.1 iPSCs技术出现新的技术潮流科学的发展潮流永无止息。科学家们使用iPSCs 在再生医学领域中已取得不断的进展。iPS
18、Cs技术可以将患有某种特定疾病的病人的成体细胞重编程为人类干细胞, 从而使iPS细胞中包含一套完整的导致该疾病的基因, 这相当于构建了研究该病并测试新药物和疗法的良好人类模型。将来, 在培养皿中即可利用iPS细胞为各个病人进行药物安全性和有效性测试。George Daley44( 建立特定疾病的iPSCs) 和Kevin Eggan45(ALS病人来源的iPSCs 能够分化成运动神经元) 领导的团队在建立特定疾病iPSCs 的开创性研究之后, 过去三年中已经发表了100 多份使用特定疾病的iPSCs 报告。 使用特定病人的iPSCs 既可重演单基因遗传性疾病表型也可重演迟发性多基因遗传性疾病的
19、表型, 如帕金森氏病46、阿尔茨海默症47-49和精神分裂症50。用这些细胞来分析疾病机制和研究潜在的新治疗方法, 环绕这些方面的潜在应用, 已经成为研究的兴奋点。来自iPSCs 的体细胞, 特别是心肌细胞和肝细胞, 可以替代现有的方法用于毒理学试验51。除了这些医疗应用, iPSCs可用于动物生物技术。其中最引人注目的iPSCs 应用来自Nakauchi 及其同事们的报道, 他们将大鼠的iPSCs 通过显微注射, 移植到因缺乏一个重要基因而胰腺不能发育的小鼠囊胚后, 小鼠胚胎发育后产生了大鼠胰腺52。将来, 使用类似的策略可能实现生产器官来供给人体移植。iPSCs 技术出现另一种研究潮流是将
20、一种体细胞“直接重编程”为另一种细胞。正如上面提到的, 对于大多数体细胞, 还没能找出一个单一“主控的”转录因子。然而, 根据iPSCs 重编程的成功经验, 科学家们转而寻找因子的组合。Melton及其同事报道了使用含有3种转录因子的组合将小鼠胰腺内分泌细胞转化为外分泌细胞53。在他们开创性的工作之后, 有许多报道是将成纤维细胞在体外转换为各种其他体细胞的例子10, 如神经细胞、肝细胞、心肌细胞和造血祖细胞。直接重编程简单、快速。剩下的障碍是如何获得足够量的靶细胞用于下游的应用。这种新技术的最佳用法可能是原位直接重编程54。直接重编程具有许多的优势, 能够将成体细胞直接重编程为其他类型的细胞而
21、无需先将成体细胞恢复至多能状态。4.2 iPSCs技术临床应用研究进展4.2.1镰刀形红细胞贫血症2007年, Hanna 等人55开创性地在小鼠中用iPS 细胞治疗了镰刀形红细胞贫血症(sickle cell anemia).随后有大量的iPS细胞应用于临床治疗的研究被报道。4.2.2 帕金森氏病/阿尔兹海默症帕金森病作为一种中、老年人的疾患, 其发病率随年龄而上升.其主要病理改变是中脑黑质多巴胺能神经元渐进性变性坏死. 2002年首次报道胚胎干细胞分化产生的多巴胺神经元向纹状体移植治疗帕金森病大鼠模型获得成功5657.Wernig 等人58通过体外培养将 iPS 细胞分化为神经前体细胞(n
22、eural precursor cells), 并形成神经元和神经胶质细胞. 将iPS 细胞衍生的神经细胞移植入胎鼠脑中, 这些细胞可整合进受体鼠的脑中, 形成神经胶质细胞和神经元细胞 .该实验证明了用iPS 细胞进行细胞替代疗法治疗神经系统疾病的可行性.2011年, Kriks等人59报道利用iPS细胞治疗帕金森氏病取得了进展。利用帕金森症患者的皮肤细胞培育出了iPS细胞，并能将其分化为多巴胺神经元细胞，这是帕金森症患者大脑中所缺少的一种重要细胞。4.2.3心血管疾病2008年和2009年, Narazaki等人60和Zhang 等人61分别将小鼠和人的iPS细胞分化为多种心血管细胞, 例如
23、, 血管内皮细胞、淋巴内皮细胞和心肌细胞, 证明了iPS细胞治疗心血管疾病的应用价值.2013年, Cell Stem Cell报道了日本利用iPS 细胞开发出低成本大量制作心肌细胞的方法62.使用该制作方法得到的心肌细胞中几乎不存在具有癌化风险的iPS细胞或ES细胞.实验证明,将心肌细胞移植到猴子的心脏中也不会发生癌化.福田教授说,“该方法不需要利用昂贵的设备进行细胞筛选即可获得纯度高达99% 的心肌细胞.”4.2.4癌症日本科学家的最新研究结果表明, iPS 细胞可用来大量培育具有抗癌功能的免疫细胞, 将来有望在此基础上开发出治疗癌症的新型免疫疗法.研究结果发表在近期的Cell Stem
24、Cell上6263.现有的免疫疗法常是单纯刺激患者的T淋巴细胞以使其增殖, 但是由于难以大量增加, 效果很有限. 此次开发的方法能够大量培养T淋巴细胞, 所以有望解决这个问题.5 iPSCs研究现状的文献计量学分析查阅反映期刊的影响力大小的SCI影响因子(journal citation reports) , 2009年Cell Stem Cell(干细胞研究领域的权威杂志)影响因子达到了23.563, 继2008年这一刊物影响因子达到16.826之后再次飞跃。2011年（2012年的结果将在今年6月公布）其影响因子继续保持高位, 达到25.421。Cell Stem Cell创刊不到6年,
25、影响因子从0一冲至16.826,又达到了25.421, 这主要得益于近几年来干细胞领域发展迅速, 潜力巨大。另外一个生命科学领域刊物影响因子发展迅猛的是国内的Cell Research：其2009年的影响因子从4.535升至8.151, 在国际细胞生物学领域发表原创论文的147种核心期刊中排名第14位, 首次进入前10%, 并连续5年在中国科技期刊中排名第一。2011年该刊物影响因子为8.19。5.1 iPSCs研究年度发展趋势对20002013年iPSCs领域的文献进行检索, 检索到相关文献6429篇(数据库更新日期为2013年4月13日, 由于数据库收录的滞后性, 2013年的数据未完全收
26、录, 仅供参考),文献数量呈现逐年上升的趋势。自iPSCs于2006年诱导成功后, 相关研究得到了世界各国的广泛关注, 许多科研机构和研究人员投入到iPSCs的研究中。对该领域研究的重视程度也体现在文献的数量上, 在短短的4年时间内, iPSCs相关文献的数量已经达到近千篇。5.2 iPSCs研究国家(地区)分布分析对iPSCs研究文献的国家(地区)分布分析发现64, 美国以显著的文献数量优势位居首位, 其发文量占总文献量的近半数。中国虽然位居第4位, 但是文献量仅有71篇, 与美国、日本等发达国家仍然存在较大的差距。被引频次能够在一定程度上反映文献的质量, 一个国家发表文献的篇均被引频次则能
27、够从一个侧面反映该国的研究水平。此外, 利用各国的篇均被引频次与其相对比, 从中可以看出各国的科研实力在国际上的相对水平。从这两个指标来看, 日本的科研水平相对较高, 而美国尽管在文献数量上超过日本, 但文章的平均质量不及日本。我国在iPSCs领域中的科研实力与世界先进水平相比仍然存在一定的差距, 但近年来, 我国的科研工作者正在不断努力, 并获得了一系列具有国际影响力的科研成果, 使中国在iPSCs领域的研究不断向世界先进水平迈进。5.3 iPSCs研究机构分布对从事iPSCs研究的机构进行分析发现64, 文献量前20位的机构中, 一多半来自美国。美国哈佛大学和日本京都大学分别排在前两位,
28、这两个机构也是iPSCs研究的开创者。中国只有一个机构进入前10位的行列, 即中国科学院, 位列第5位, 但文献数量与国际先进机构相比仍然具有较大差距。6总结和展望我们相信, iPSCs技术对于许多应用（包括干细胞疗法）已准备就绪。iPS细胞技术在未来将在这三个方面有作用：1 再生医学。iPSCs技术所建立的体系能为当前人们很难解决的疾病提供可行的医疗方案。iPS细胞由患者自身体细胞诱导产生，可以避免伦理、免疫排斥等问题. 因此，iPS细胞有更广阔的应用前景，在再生医学领域有巨大的应用潜力和优势.2 药物安全性试验。许多的药物所导致的健康问题是直到临床试验才发现的。利用iPS技术，利用重编程人
29、类成体细胞形成心脏细胞，将之用于药物研发过程的早期阶段的毒性试验，从而实现节省花费在昂贵的动物及人体试验上的时间与成本。3 个体化医学。由于每个病人独特的遗传组成，药物在不同病人身上所产生的反应也不同。利用病人自身的细胞，研究者可以通过iPS细胞来生成具有病人DNA的大脑、心脏、肝脏等器官以及其他细胞。这些细胞然后可以被用于特定患者的药物反应试验，或者用于移植与再生。参考文献1 Takahashi K, Yamanaka S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultur
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