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1、注射用重组人干扰素1b从干扰素最初发现到现在已经过去50年，当年英国科学家Isaacs和Lindenmann发现用加热灭活的流感病毒孵育小鸡尿囊绒膜会产生一种物质，它能对肝病毒的感染产生抵抗。1957年,Proc R Soc Lond B Biol Sci刊登了他们的论文,在这篇论文中,Isaacs和Lindenmann将这种因子命名为干扰素(INTERFERON)。从1980年代后期开始,借助分子生物学技术的发展,科学家们对干扰素的研究更加深入,各型干扰素、干扰素亚型及其功能逐渐为人们所认识,目前已经确认干扰素三种主要生物学作用为抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用。同时,由于DNA重组技术应用,干
2、扰素制备技术也得到很大提高, 干扰素的研制经历了人白细胞干扰素、重组技术干扰素等阶段。但在重组DNA技术发展和应用以前，分离纯化工艺的收率较低，而且有潜在病毒污染的危险。1981年重组DNA技术的成功,提供了一种经济的方法得以产生大量纯化的重组人干扰素。【1】干扰素是一组多功能的细胞因子，根据其氨基酸结构、抗原性和细胞来源，可将其分为三类：IFN-, IFN-和IFN-。干扰素为多基因产物，分为许多亚型，其中IFN-1b主要用于抗病毒治疗、抑制和杀伤肿瘤细胞以及免疫调节。中国生物制品规程1995年版开始收载细胞因子类制品，分别是 “冻干精制人白细胞干扰素”，“冻干基因工程干扰素1b”, “冻干
3、基因工程干扰素2a”。 “冻干精制人白细胞干扰素”是用特定的诱生剂诱导健康人白细胞，经提取后制成的冻干干扰素。由于该制品生产原料来源困难，工艺复杂，收率低，价格昂贵，并且具有血源性病毒污染的潜在风险，随着基因工程干扰素的出现已被淘汰，中国生物制品规程2000年版不再收载该制品。从中国生物制品规程2000年版起，采用重组DNA技术生产的干扰素1b制品命名为“重组人干扰素1b”。基因工程干扰素1b是通过重组DNA技术将人干扰素1b的编码基因引入某种工程菌（大肠杆菌）后，高效地表达该基因产物，再经分离、纯化、冻干制得。重组人干扰素1b（rhIFN-1b）是一种高度纯化的水溶性蛋白质，分子相对质量约为
4、19kD，半衰期为412小时。由于干扰素在体内半衰期短，且长期使用易产生抗体，影响药效的发挥，目前国外已有聚乙二醇化干扰素上市，并已在我国注册上市。聚乙二醇是一个以-CH2CH2O-为基础结构的大分子的线性多聚体，常用来进行蛋白质的修饰，该物质与蛋白质的共价结合，即聚乙二醇化可以改变干扰素生物物理特性，包括分子大小、疏水性及电荷等，提高干扰素分子量，并降低免疫原性，延长其在体内的半衰期，在临床上能更好地发挥治疗作用。【2】【3】 【制造概要】注射用重组人干扰素1b（注射用无菌粉末）系由高效表达人干扰素IFN-1b基因的大肠杆菌，经发酵培养、菌体分离和蛋白质纯化后制成（或经过冻干制成），含适宜稳
5、定剂，不含防腐剂和抗生素。【4】1工程菌菌种1.1 工程菌菌种名称及来源【5】以微生物为操作对象，将目的基因导入宿主菌，是生产重组人干扰素1b的基础。工程菌的构建包括目的基因克隆、表达载体构建、遗传转化与筛选等阶段，其间涉及了PCR、DNA文库、化学合成、酶切、连接外源基因、基因导入与微生物培养等技术。宿主菌和载体的名称是工程菌的基本信息。大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强的特点；但是，不能用于加工修饰（糖基化、酰胺化）蛋白质的表达；细胞死亡后，易形成内毒素；N末端增加的蛋氨酸也容易引起免疫反应；一般以包涵体的形式表达目的基因。在药品标准中注明工程菌
6、的种类以及载体是十分必要的。1.2 种子批建立及保存重组人干扰素1b的生产采用三级种子库的形式，包括：原始种子批、主种子批和工作种子批，应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定和要求。原始种子批建立后，经过扩增传代而建立主细胞批，然后再传代建立工作种子批。三级种子批之间的传代代次、保存方式应相对固定，以保证制品的稳定性和均一性。生产单位将种子批以一定浓度的甘油保存于甘油管中，并置于液氮罐中保存；或者将菌种加入保护剂冻干后置于-80冰箱中保存。1.3 菌种检定菌种的检定包括菌种特性、生产能力、质粒稳定性等方面。菌种特性方面的检定包括（以大肠杆菌为例）：集落形态、革兰氏染色特征、生化特性、
7、电镜检查特征、对抗生素的抗性等。生产能力方面的检定包括：目的蛋白的表达量、型别等，其中，每批菌种的表达量应均一稳定，不应有明显的表达量的降低。质粒的稳定性以质粒的酶切图谱作为依据。为加强对菌种的控制，中国药典2010年版三部增加了目的基因核苷酸序列检查。由于基因重组产品的目的基因是通过基因工程技术导入宿主细胞中的，在多次传代或长期保存过程中，有可能导致目的基因中个别核苷酸的突变，当突变发生在目的蛋白的关键位点时，有可能导致目的蛋白的性质发生变化。因此，增加这项检测项目，从基因水平确保了目的蛋白的准确性。2 原液原液的制备是生产工艺中最为重要的技术步骤，包括发酵、纯化等工艺过程。2.1 种子液制
8、备将工作种子批菌种复苏、扩增至一定数量制备种子液，用于发酵罐培养。2.2 发酵用培养基培养基的控制是发酵工艺的基本要素。培养基的成分包括：碳源、氮源、无机盐、选择剂、诱导物等。大肠杆菌以蛋白胨等蛋白质的降解物作为碳源和氮源；为了维持工程菌的纯正性和质粒的稳定性，根据质粒上的选择性标记基因，在发酵初期的种子液制备过程中可添加选择剂。大肠杆菌以卡那霉素、氨苄青霉素等抗生素作为选择剂。在工程菌生长到一定阶段，可通过添加诱导物或改变培养温度，以解除目的基因的抑制状态，活化基因，进行转录和翻译，生成产物，一般在菌体生长的对数期或稍后阶段进行诱导表达。以Lac启动子为表达系统的工程菌用异丙基-D-硫代半乳
9、糖苷（IPTG）作诱导剂。本版药典对残留的IPTG诱导剂还没有灵敏的检测方法，在生产过程中应严格控制IPTG的使用量。为了避免微生物对菌种的污染，制备种子液的培养基可以加适量抗生素。在干扰素工程菌发酵培养过程中，种子液所占体积较小，加入发酵液后，因高倍数的稀释作用，使抗生素的水平大大降低，再经过后续的纯化过程，抗生素的含量降低到可忽略的程度，但是在生产用培养基中禁止加入抗生素，以控制终产品中残留抗生素的含量。2.3种子液接种和发酵培养温度、pH、溶解氧、补料、罐压、通气量、发酵时间是发酵工艺及工艺控制的重要元素，生产单位应严格按照批准的工艺进行。不同工程菌对温度的要求不同：大肠杆菌生长最适温度
10、为37，最高温度为45。为了达到不同的目的，在工程菌的不同生长阶段，发酵工艺设置的温度也不同。发酵过程中pH值的调节应兼顾工程菌生产状况和表达产物的稳定性。研究发酵过程中各个阶段适宜的pH值后，需要进一步分阶段控制pH，设法使其在合适的范围内，达到最佳生产水平。大肠杆菌为需氧微生物，生长过程需要大量氧，且溶氧量对质粒稳定性也有一定的影响，可以通过调节搅拌转速和通气量对其进行控制。为了加强对制品稳定性的控制，在2005年版药典中，增加了对发酵液中菌体质粒丢失率检查的项目。在实际检测中，取一定量的发酵菌体，经过适当稀释后涂布在不含抗生素的培养基上，待菌落长成后，挑取100个或以上菌落，分别接种到含
11、抗生素和不含抗生素的培养皿中，比较二者差别，计算质粒丢失率。质粒丢失率超出规定的范围的，表明菌种的稳定性较差，亦会影响目的蛋白的表达量。在发酵生产中,应注重发酵工艺的优化，可采用多种方法的结合。如增加诱导表达前菌体的总量、适当提高溶氧量、延长诱导表达时间等方法均是优化发酵工艺的常规手段。2.4 发酵液处理发酵工艺结束后，采用高速连续离心机离心收集菌体，如果目的蛋白在胞内表达，离心后的上清液经灭菌后弃去。菌体的破碎主要采用超声破碎、高压均质破碎等方法。菌体破碎的效果与收获的目的蛋白量成正相关。2.5初步纯化初步纯化工艺主要对目的蛋白的初步捕获，一般采用离心、透析、盐析、层析、超滤等技术。在干扰素
12、1b的生产过程中，采用包涵体形式表达目的蛋白，则收获菌体后，需要进行破菌（超声波或高压匀浆法破菌）、离心后得到粗制包涵体，再将包涵体溶解在盐酸胍-二硫苏糖醇溶液中，即为干扰素的粗提物。采用可溶性蛋白形式表达目的蛋白，则收集的菌体经裂解、收集上清、盐析、收集沉淀物、溶解沉淀物、脱盐等步骤制得干扰素的粗提物。干扰素粗体物经进一步复性、透析等步骤，即为复性好的干扰素原液，进入高度纯化工艺。收集的菌体经裂解、收集上清、盐析、收集沉淀物、溶解沉淀物、脱盐等步骤得到干扰素的粗提物。【6】2.6 高度纯化重组蛋白在菌体中与许多不同的蛋白质、核酸及多糖以复杂的混合物形式存在，因此蛋白质的分离和纯化工艺的选择非
13、常重要，不同生产单位应根据自身产品的理化和生物学特点，选择不同的层析技术来分离目的蛋白。高度纯化工艺一般是采用各种色谱技术，包括凝胶过滤层析、离子交换（DEAE）层析、疏水层析、亲和层析及分子筛柱(S100)层析等。经过初步、高度纯化后得到的原液加入适宜稳定剂（人血白蛋白），即为干扰素原液。在制品中加入人血白蛋白作为稳定剂是许多基因重组产品的通常做法，这是由于高分子化合物的优先吸附作用，可对重组蛋白的生物活性起保护作用。但是，同时应当考虑人血白蛋白本身可能带来的潜在病毒污染风险，以及加入的白蛋白与目的蛋白形成结合物，影响成品中目的蛋白含量的测定，导致难以对产品的比活性进行评价的不足，因此，以非
14、人血白蛋白作为稳定剂是该制品发展的方向。 3 半成品将检定合格的加稳定剂的干扰素原液，用稀释液稀释至所需浓度，用0.22m的膜除菌过滤后即为半成品。半成品配制一般采用注射用水或0.9%氯化钠溶液为溶剂，以白蛋白作为支架及稳定剂。4 成品半成品经过分装、冻干、包装等工艺后，即得成品。由于不同保护剂的作用原理不尽相同，例如：糖、多元醇等通过影响水分子构象而加强与蛋白质的疏水相互作用,以抵抗热变性,使溶液中的蛋白质构象得以稳定；多羟基化合物是常用的冷冻保护剂,可以减轻低温对蛋白质结构的破坏作用，因此，应根据各种可能的影响因素，如制品的成分、加入稳定剂的种类和配比量、性质、浓度、装量以及升华面积和共熔
15、点、热传导的介质和方式、凝结器温度、冷凝器面积和制冷能力、系统真空度和设备性能等，确定最佳冻干曲线。7,8，9 【检定概要】原液检定重组蛋白制品的检定着重于对分子结构的确认，主要包括鉴别、分子量、等电点、特征光谱、肽图、N端氨基酸序列等项，此外，还包括生物学活性、蛋白质含量、纯度检测等内容。1生物学活性干扰素的活性测定采用的是细胞病变抑制法。依据干扰素可以保护人羊膜细胞（WISH）免受水泡性口炎病毒（VSV）破坏的作用，用结晶紫对存活的WISH细胞染色，在波长570nm处测定其吸光度，可得到干扰素对WISH细胞的保护效应曲线，以此测定干扰素生物学活性。在生物学活性测定过程中，WISH细胞的生长
16、状态、VSV病毒的毒力、攻毒后的培养环境以及染色反应的温度和时间均可对检测结果产生影响，因此，应对各种检测条件进行控制，尽可能减少对试验的影响。中国生物制品规程1995版系采用显微镜下肉眼观察细胞病变并计数的方法判定结果；自中国生物制品规程2000版起，修订为采用细胞染色法测定吸光度，使结果判定更加客观、准确。在生物活性测定中，欧洲药典采用的受试细胞和攻击病毒与中国药典不同，采用人喉癌细胞株（Hep2c）和脑心肌炎病毒（EMCV）。2纯度（1）电泳法采用非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法。检测时除了注意分离胶的浓度、加样量等因素，还应使制备供试品的方法、电泳胶的厚度、样品池的体积、电压或电流
17、等实验条件保持一致。（2）HPLC法本版药典采用的是分子筛层析法对制品的纯度进行分析，该方法的原理是基于分子大小的差异对不同蛋白质进行分离。建议逐步开展采用反相高效液相法测定纯度的研究工作；采用两种不同原理的检测方法对其进行检测，以互相补充，可以更准确的测定制品的纯度。系统适用性试验包括理论塔板数、分离度、重复性和拖尾因子等。3外源DNA残留量从2000年版中国生物制品规程收载了DNA探针杂交法，2010年版药典三部新增了荧光染色法。DNA探针杂交法是较为经典的方法，但是操作较为复杂，耗时长；荧光染色法操作简便快捷，准确灵敏。应根据品种特性及限度要求等具体情况，选择适宜方法。4宿主菌蛋白质残留
18、量采用ELISA法对宿主菌蛋白质残留量进行测定。5残余抗生素活性采用培养法。该方法的灵敏度较低，耗时长。以相应抗生素的单克隆抗体的间接竞争ELISA法检测残余抗生素活性已得到广泛应用，该法更为方便、准确和灵敏。6、分子量、等电点、紫外光谱、肽图、N端氨基酸序列以上检测是对重组蛋白分子结构进行确认的重要指标。分子量采用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定制品的分子量。以-巯基乙醇（或二硫苏糖醇）作为还原剂处理供试品，使其二硫键断裂。在分子相对质量为15kD-200kD范围内，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。等电点等电点是蛋白质所属的特殊性质。当氨基酸的各种带电离子所带正电荷数与负电荷数相等
19、时，此时溶液的pH就是这种氨基酸的等电点。从理论上讲，一种蛋白质只有一个等电点，但等电点测定结果受实验方法和条件（溶剂性质、离子强度等）影响较大。等电点应为4.0-6.5。紫外光谱200-400nm范围称为近紫外区，许多化合物在这一区域产生特征吸收。紫外光谱是指分子中的某些价电子吸引一定波长的紫外光，由低能级跃迁到高能级而产生的吸收光谱。在波长为230-360nm下进行扫描，干扰素1b的最大吸收峰波长应为275-281nm。肽图通过蛋白酶（胰蛋白酶）或化学物质（溴化氰）裂解蛋白质后，采用高效液相法对其进行分离，将得到的供试品图谱与对照品图谱进行比较，分析鉴定蛋白质一级结构的完整性和准确性。自2
20、010年版药典起，原液肽图检查由每半年检测一次修订为每批进行检查，以控制产品批间稳定性。N端氨基酸序列分析氨基酸序列测定是通过控制蛋白质的二、三级结构，保证蛋白质的生物学活性。历版药典采用氨基酸序列分析仪测定法，对N端的15个氨基酸序列进行测定。从2010年版药典起要求对N端的16个氨基酸序列进行测定。由于AUG不仅是原核细胞表达载体的起始密码子，还编码甲硫氨酸，因此干扰素1bN端的起始氨基酸为甲硫氨酸。但是，有些采用可溶性蛋白表达的干扰素1b 的N端甲硫氨酸随前导肽的切除而被切除。欧洲药典收载的同类产品（如IFN-2a、IFN-1b）原液检测项目与中国药典的差别主要在相关蛋白检测及杂质分析等
21、方面。欧洲药典采用还原、非还原电泳法测定杂质成分；采用高效液相色谱法对相关蛋白进行分析【10】。三种检测方法侧重点有所不同，还原电泳主要测定目的蛋白的含量及分子量，非还原电泳主要测定蛋白聚体及杂蛋白的含量，高效液相色谱法除能测定杂蛋白含量外，还可测出目的蛋白的异构体，同时对非蛋白类杂质也可有效检出。因此这三种方法联合使用，可对制品的纯度进行有效控制。半成品检定包括细菌内毒素含量、无菌检查、生物学活性检测等项目。成品检定包括鉴别试验、外观、可见异物、装量、pH值、渗透压摩尔浓度、生物学活性测定、残余抗生素活性、无菌检查、细菌内毒素检查、异常毒性检查等项目。中国药典2010年版的鉴别试验收载了免疫
22、印迹、免疫斑点两种方法。其原理均采用供试品与特异抗体结合后，抗体再与酶标抗体特异性结合，通过酶学反应的显色，对供试品的抗原特异性进行检查。免疫印迹法与免疫斑点法相比，增加了电泳技术，可以对供试品起到浓缩和分离的作用。在免疫印迹法检测中，应只有目的蛋白带显色，不应有其他杂蛋白带显色。在方法建立过程中，应对检测方法的特异性进行验证。中国药典2005版三部在干扰素1b成品检定中增加了装量差异和可见异物检查项目。中国药典2010版三部在干扰素1b成品检定中增加了渗透压摩尔浓度测定，其主要目的是控制制品的批间一致性。由于不同生产企业的生产工艺、配方可能存在差异，尚难以制定统一的渗透压摩尔浓度限度规定，企
23、业应根据各自产品的特性确定合理的渗透压摩尔浓度限度。保存、运输及有效期中国药典三部2005年版规定，产品的效期自分装或自冻干完成之日起计算。中国药典2010年版对产品有效期统一规定为自生产之日起计算（“生产之日”为制品的“配制之日”）。参考文献1 生物技术药物研究开发和质量控制，王军志主编2 聚乙二醇化重组人干扰素2b的质量控制，中国生物制品杂质，2005年1月第18卷第1期。张雪梅，郭桥等3 长效干扰素：聚乙二醇干扰素研究进展，中华肝脏病杂志2002年2月第10卷第1期。马慧，王豪4 中国药典2010版5 生物技术药物马大龙主编6重组人干扰素2b包涵体纯化方法的研究，中国生化药物杂志，2001年第22卷第6期。杨欣，曾献武等7.微生态制剂冻干工艺的探讨，上海医药，2005年第26卷第8期:366-367. 王雪松，张亮8.凝血酶冻干制剂冻干工艺选择研究，微生物学免疫学进展，2005年第33卷第4期：44-48。崔焰,陈冬梅, 白植生,马庆华,张军,韩德胜9重组HIV21腺病毒载体活疫苗的冻干保护剂研究，中国生物制品学杂志2007年2月第20卷第2期：104-106。张一折，滕洪刚，吕帅然，姜春来，于湘晖，孔维10 欧洲药典（7.0 版）- 9 -
