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1、胰岛素样生长因子受体基因单核苷酸多态性与非小细胞肺癌铂类化疗疗效及预后的研究【摘要】目的 胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R）基因是调节细胞生长分化的重要基因，胰岛素样生长因子2受体（IGF-2R）基因是潜在的肿瘤抑制基因，本研究探讨胰岛素样生长因子受体基因IGF-1R+1013(G/A)、IGF-2R+1619(G/A)单核苷酸多态性与非小细胞肺癌(NSCLC)患者对铂类药物为基础的化疗方案疗效及预后的关系。方法 经病理确诊的132例初治肺癌晚期患者经含铂方案化疗四周期后评价临床疗效，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测IGF-1R+1013(G/A)和IGF-2
2、R+1619(G/A)的基因型，分析其基因多态性与化疗临床受益率及生存期（MST）的关系。结果 1）未发现IGF-1R+1013(G/A)基因多态性和IGF-2R+1619(G/A) 基因多态性与化疗疗效有明显关系，P0.05，联合分析未发现两基因多态性与化疗疗效有联合作用（2=0.216，P=0.975）。2）IGF-1R+1013(G/A)变异等位基因A携带者(GA+AA)的MST短于GG基因型携带者(2=7.005，P=0.017)，IGF-2R+1619(G/A)变异等位基因A携带者（GA+AA）和GG基因型携带者的MST的差异无统计学意义(2=0.212，P=0.645)。联合分析发
3、现，两基因多态之间存在联合作用，同时携带IGF-1R+1013(G/A)突变等位基因A和IGF-2R+1619(G/A)突变等位基因A的患者(GA+AA)的MST为12个月，明显短于携带其它基因型的患者（P0.05.Furthermore,we found that the two SNPs couldnt work together,P0.05. 2)Median survival time (MST)of patients with IGF-1R+1013(G/A) genotypes with A allele (GA+AA)were significantly shorter than
4、 those of GG genotype carriers(2=7.005，P=0.017). There was no difference of MST in patients with IGF-2R+1619(G/A) A allele (GA+AA) carrier and GG genotype carrier(2=0.212，P=0.645). The two SNPs showed a synergic effect on MST, The patients who carried mutant allele A of IGF-1R+1013(G/A) and mutant a
5、llele A of IGF-2R+1619(G/A) had MST of 12 months which was significantly shorter than that in patients with other genotypes (P 3个月。所有病人均签署知情同意书且依从性好, 能够进行随访。“吸烟”指从开始吸第1支烟到目前为止，1年内吸烟量大于或等于100支或每周至少2支，连续1年以上。TNM分期UICC第七版肿瘤分期，组织类型根据2004年WHO公布的“肺及胸膜肿瘤组织学分类修订方案”，将大细胞肺癌和未分化及未定性肺癌统称为其他型肺癌。1.2化疗方案及评价标准：根据患者
6、肺癌的细胞类型和患者的全身情况制定化疗方案，132例患者接受以顺铂(cisplatin,DDP) 或卡铂(carboplatin,CBP) 为主的方案化疗，其中14例采用DDP/CBP联合伊立替康（CPT-11）治疗（IP方案），46例采用用DDP/ CBP 联合吉西他滨( gemcitabine , GEM) 治疗（GP方案），28例采用采用DDP/CBP 联合去甲长春碱( vinorelbine ,NVB)治疗（NP方案），31例采用采用DDP/CBP 联合紫杉醇(paclitaxel,TAX) 或多西紫杉醇( docetaxel ,DOC)治疗（TP方案）治疗，13例(4. 0 %)采用
7、DDP 联合培美曲塞二钠(pemet rexed disodium ,PEM)治疗。上述各方案每3周为1 个周期，疗程为4周期, 根据2009年美国国立癌症研究所实体瘤客观疗效评定标准修订版RECIST1.1进行疗效评价6 Eisenhauer EA, Therasse P, Bogaerts J, et al. New response evaluation criteria in solid tumours: Revised RECIST guideline (version 1.1). Eur J Cancer, 2009, 45(2): 228.6,分为完全缓解(complete re
8、sponse ,CR) 、部分缓解(partial response , PR) 、稳定( stable disease ,SD) 和进展(progression disease , PD) ，设定CR+PRSD且持续时间24周为临床受益。 对化疗有效和病灶稳定的患者所采取的治疗策略应为停止化疗, 进人观察随访期, 出现新的病灶后再进行二线治疗或复治。生存时间指确诊、期肺癌开始至死亡或末次随访时间，所有患者均采用电话随访，随访截止时间为2011年9月23日。1.3实验方法1.3.1基因组DNA的提取：抽取每个研究对象外周肘静脉血5ml，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，离心并分离白细胞，用DNA提
9、取试剂盒提取白细胞基因组DNA，核酸分光分度计对DNA的浓度和纯度进行检测，所有标本OD260OD280值在1.8-2.0之间符合PCR要求，DNA 置-20低温冰箱保存备用。1.3.2聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析：根据文献设计引物，IGF-1R+1013（G /A）（rs2229765）的上游引物：5- CAGGGGTCGTTTGGGATGGTC-3；下游引物：5-CCTGTGCTGC ATTTTGGCGGCTTTTC-3。 IGF-2R+1619（G/A）（rs629849）的上游引物：5-AACAATGGTTAAAGCCGGATTG-3,下游引物为； 5-G
10、GCCCGGGTGCAGCCAGGCACTG -3。 PCR扩增体系（25ul）含0.4umol/L上下游引物，0.02mmol/L dNTP，1.25U TaKaRaTaq酶，1PCR buffer， 100ngDNA模板，加蒸馏水至25ul。IGF-1R PCR反应条件为：94预变性10分钟，94变性20 s，54退火20 s，72延伸30s；共36个循环，末次循环后，72再延伸10 min，产物为207bp。IGF-2R PCR反应条件为：94预变性5分钟，94变性30 s，67退火60 s，72延伸30 s；共30个循环，末次循环后，72再延伸15 min，产物为456bp，以蒸馏水替
11、代模板DNA 作为阴性对照。取10ul PCR反应产物、1U限制性内切酶，10buffer tango 2ul，18ul无菌去离子水，37水浴过夜。取5ul酶切产物经3 g/L琼脂糖凝胶电泳, 100 V 20 min， 凝胶成像系统分型，IGF-1R PCR产物经酶切后出现103 bp、84 bp片段为GG纯合基因型，出现84bp、123bp片段为AA纯合基因型, 出现103bp、84bp、123bp片段为GA 杂合基因型；IGF-2R基因PCR产物经酶切后出现307 bp和149 bp片段判定为GG纯合基因型,出现完整456 bp 片段判定为AA纯合基因型,出现456bp、307 bp 和
12、149 bp 片段,则判定为GA杂合基因型，结果见图1，2。 M 1 2 3 4 5 M 1 2 3 4 5400bp 400bp 200bp 200bp100bp 100bp图1 IGF-1R+1013(G/A) PCR 图2 IGF-2R+1619(G/A) PCR产物经限制性内切酶MnlI消化 产经物制性内切酶NciI消化后的电泳图. M: marker；1泳 后的电泳图. M: marker；3泳道：GG型；3泳道：AA型； 道：GG型；2泳道：AA型； 2，4泳道：GA型；5泳道： 1，4泳道：GA型；5泳道：阴性对照 阴性对照Fig.1 The agarose gel electr
13、op Fig.2 The agarose gel electrop-horesis of IGF-1R+1013(G/A) -horesis of IGF-2R+1619(G/A) by restrict endonucleases MnlI. by restrict endonucleases NciI. M:maker; Lane1:GG genotype； M:maker; Lane3:GG genotype；Lane3:AA genotype；Lane 2,4: Lane2:AA genotype；Lane 1,4:GA genotype；Lane5: negative GA geno
14、type；Lane5: negativecontrol control 1.3.3 DNA测序：取50l PCR产物连同其上游引物由英潍捷基贸易有限公司,采用双脱氧法在ABI_3730XL 测序仪上进行单向测序，测序结果与PCR-RFLP方法一致。1.4 统计学分析 采用SPSS 18. 0 软件，建立非条件Logistic 回归模型评价IGF-1R和IGF-2R基因多态性与铂类化疗疗效的关联，以比值比（OR）及其95%可信区间表示基因型与疗效的相关性。采用Kaplan-Merier法进行单因素生存分析, Log-rank 检验验比较不同基因型的生存期差异，Cox 比例风险模型评估各可能的影响
15、因素对化疗疗效的影响，双侧检验P0.05；IGF-2R+1619(G/A)GG、GA、AA基因型携带者和变异等位基因A携带者(GA+AA)的临床收益率分别为75.3%、76.6%、75.0%和76.5%，差异无统计学意义，P0.05。联合分析发现，IGF-1R+1013(G/A)基因型与IGF-2R+1619(G/A)基因型对化疗疗效无协同作用（2=0.216，P=0.975）。表1 晚期肺癌患者临床特征、IGF-1R和IGF-2R的基因型与铂类化疗疗效的关系Table 1 The clinical features, IGF-1R and IGF-2R genotypes and effic
16、acy of platinum- based chemotherapyCharacteristicsNCR+PR+SD( %)dPD( %)dOR(95%CI)eP eTotal132100(75.6)32(24.4)GenderFemale4739(83.0)8(17.0)Male8561(71.8)24(28.2)0.25(0.07-0.83)0.023Age ( year)60待添加的隐藏文字内容26547(72.3)18(27.7)60 22(57.9)6753(79.1)14(20.9)2.15(0.80-5.80)0.129Smoking statusNo smoking6547(
17、72.3)18(27.7)Smoking6753(79.1)14(20.9)3.23(0.99-10.58)0.053HistologyaSCC3329(79.9)4(12.1)AC7051(72.9)19(27.1)0.42(0.11-1.55)0.190Others2920(69.0)9(31.0)0.39(0.08-1.91)0.34pTNM stage5346(86.8)7(13.2)7954(68.4)25(31.6)0.40(0.14-1.10)0.076Chemotherapy regimenbIP149(64.3)5(35.7)1.00-GP4634(73.9)12(26.1)
18、1.11(0.20-6.18)0.905NP2823(82.1)5(17.9)1.55(0.24-9.91)0.645TP3124(77.4)7(22.6)1.47(0.24-9.05)0.676DDP+PEM1310(76.9)3(23.1)1.37(0.19-9.68)0.753IGF-1RGG4937(75.5)12(24.5) 1.00-GA6952(75.4)17(24.6)0.85(0.34-2.16)0.739AA1411(78.6)3(21.4)0.88(0.18-4.34)0.879GA+AAc8363(75.9)20(24.1)0.86(0.35-2.10)0.737IGF
19、-2RGG8161(75.3)20(24.7)1.00 -GA4736(76.6)11(23.4)1.23(0.47-3.23)0.672AA43(75.0)1(25.0)1.27(0.10-16.46)0.875GA+AAc5139(76.5)12(23.5)1.24(0.49-3.13)0.656a SCC：Squamous cell carcinoma，AC：Adenocarcinoma，others include adenosquamocarcinoma，bronchioloalveolar carcinoma，large-cell carcinomas, unclassified
20、non-small cell lung eancerb IP:cisplatin/carboplatin+CPT-11.GP:cisplatin/carboplatin+gemcitabine.NP:cisplatin/carboplatin +vinorelbine. TP：cisplatin/carboplatin+paclitaxel/docetaxel，DDP+PEM：cisplatin+pemet rexed disodium.c the genotypes with A allele (either the heterozygous GA or the homozygous AA
21、genotypes)d CR：complete response； PR：partial response；SD：stable disease；PD progression diseas e Adjusted for age ,gender , smoking status,histology ,clinical stage , chemot herapy regimen and IGF-1R and IGF-2R.2.2 IGF-1R+1013(G/A)、IGF-2R+1619(G/A)基因多态性与生存期的关系 至随访截至日期132例晚期肺癌患者中55例死亡，无失访患者，治疗后的中位生存时间
22、(median survival time, MST)为18个月。IGF-1R+1013等位基因A携带者（GA+AA）的MST短于GG基因型携带者(2=5.721，P=0.017)。 IGF-2R+1619等位基因A携带者（GA+AA）与GG基因型携带者的MST差异无统计学意义(2=0.314，P=0.575)（表2）。联合IGF-1R和IGF-2R基因型分析显示，两基因联合多态性与NSCLC的生存期有关，与同时携带这两个基因的GG基因型的个体相比，携带IGF-1R+1013(G/A) 突变等位基因A(GA+AA)同时携带IGF-2R+1619(G/A) GG基因型的患者的MST短(2=4.6
23、46，P=0.031)；同时携带IGF-1R+1013(G/A)突变等位基因A和IGF-2R+1619(G/A)突变等位基因A的患者(GA+AA)的MST也短(2=4.196，P=0.041)，各组间生存期差异有统计学意义（表3，图3）。表2 IGF-1R+1013(G/A)、IGF-2R+1619(G/A)基因型与肺癌生存期的关系Table 2 Polymorphisms of IGF-1R+1013(G/A) 、IGF-2R+1619(G/A) and MSTGenen (%)MST(95%CI) 2PIGF-1RGG49(37.1) 21(18.60-24.77)GA+AA83(62.9
24、)14(9.78-18.22)5.7210.017IGF-2RGG81(61.4)22(13.16-30.84)GA+AA51(38.6)16(11.41-20.60)0.3140.575MST: middle survival time.表3 IGF-1R+1013(G/A)、IGF-2R+1619(G/A)联合基因型与肺癌生存期的关系Table 3 Combined polymorphisms of IGF-1R+1013(G/A)、IGF-2R+1619(G/A) and MSTIGF-1R+1013(G/A)IGF-2R+1619(G/A)n (%)MST(95%CI)PGGGG30(
25、22.7)27(18.74-29.27)ReferenceGGGA+AA19(14.4)22(0.52-43.48)0.390GA+AAGG52(39.4)16(10.74-21.26)0.031GA+AAGA+AA31(23.5)12(6.70-17.30)0.041MST: middle survival time.0102030400.00.20.40.60.81.0Survival time(months)Cum survivalGG+GGGG+GA/AAGA/AA+GGGA/AA+GA/AAGG+GG-CensoredGG+GA/AA-CensoredGA/AA+GG-Censore
26、dGA/AA+GA/AA-Censored图3 IGF-1R+1013(G/A)和IGF-2R+1619(G/A)联合基因型的生存曲线Figure 3 Kaplan-Meier plot of overall survival in relation to the combined genotypes of IGF-1R+1013(G/A) and IGF-2R+1619(G/A)2.4 COX回归模型多因素分析年龄、性别、吸烟情况、组织类型、临床分期、化疗方案、IGF-1R和IGF-2R基因多态性八项变量均进入Cox模型进行分析，IGF-1R+1013(G/A)变异等位基因A是影响NSCLC
27、预后的独立危险因素，IGF-1R+1013(G/A)变异等位基因A携带者（GA+AA）的相对危险度是GG基因型携带者的2.104倍，P=0.020。IGF-1R+1013(G/A)联合IGF-2R+1619(G/A)基因多态性是影响NSCLC预后的独立因素，P=0.025。（表4）表 4 晚期NSCLC预后影响因素的COX多因素回归分析结果Tab 4 Advanced NSCLC prognostic factors in multivariate regression analysis of COXVariableBSEWalddfP0RGender0.1870.2600.26910.604
28、1.205Age0.3680.2941.71910.1901.470Smoking status0.6180.3632.89110.0891.854Histology-0.2020.2070.95410.3290.817pTNM stage0.5110.2992.92410.0871.667Chemotherapy regimen0.1810.1232.15510.1421.199IGF-1R0.7440.3205.40310.0202.104IGF-2R0.0120.2800.00210.9651.012IGF-1RIGF-2R*0.2890.1295.04610.0251.335* Com
29、bined polymorphisms of IGF-1R+1013(G/A) and IGF-2R+1619(G/A)3、讨论IGF-1R基因定位于15q25-26，全长约100 kb，有21个外显子，IGF-2R蛋白是一种酪氨酸激酶跨膜蛋白受体，由两个a-亚基(130-135KDa)和两个亚基(90-95KDa)通过二硫键结合而形成四聚体(22), 与细胞外配体结合后，通过Ras/Raf/MEK/ERK 和PI3K/AKT两条信号传导通路促进细胞存活及抗细胞凋亡的作用7 Paveli J, Matijevi T, Knezevi J. Biological & physiological aspects of action of insulin-like growth factor peptide family. Indian J M ed Res, 2007, 125(4): 511-522.7。IGF-2R基因定位于6q26，约136kb，含有48个外显子，其
