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1、药物设计学读书报告0558009 陈己鹏获得性免疫缺陷综合症(AIDS，auquired immunodeficiency syndrome) , 是由人类免疫缺陷病毒(HIV，human immunodeficiency virus )感染而导致的一种免疫系统疾病，具有高传播率，高发病率和高死亡率，严重危及人类的健康和生活。近些年来，对于HIV抗病毒药物的研究一直持续不断，广受关注。逆转录酶、蛋白酶和整合酶是HIV-1病毒复制过程的关键酶，现有的临床治疗药物多为逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂，其缺点在于不能根除体内病毒，易产生耐药病株。整合酶负责将病毒DNA整合到感染的宿主细胞染色体中，而人体
2、细胞中不存在该酶功能类似物，因此是设计高效、低毒的抗HIV药物的理想靶点。目前报道的整合酶抑制剂有核苷酸类、肽类、苯乙烯喹啉类和多羟基芳香族类等。文献Quinolone 3-Carboxylic Acid Pharmacophore: Design of Second Generation HIV-1 Integrase Inhibitors主要讨论了以3-羧酸喹诺酮类化合物为对象开发第二代整合酶抑制剂的药物设计过程。首先，先简要介绍一下该文献的主要内容，分研究背景、研究方法、研究过程和结果四部门。I、研究背景：高效抗逆转录病毒疗法（HAART）主要包括至少20个的经美国FDA批准的抗逆转录病
3、毒的药物，能有效的抑制病毒数量至不可监测的程度，使病症转入长期，但是不能杀灭被感染人体内的病毒。鉴于艾滋病病毒较长的感染期，须将HAART疗法治疗期延长，不断出现的新的艾滋病病毒的抗性变株和长期HAART疗法的不良反应促使我们转变对HIV-1病毒复制过程的研究靶点。HIV-1病毒整合酶抑制剂和趋化因子拮抗剂作为新型的抗逆转录病毒的药物有望成为治疗艾滋病的新治疗药物。整合酶介导HIV-1病毒复制过程中关键性的催化反应。整合酶介导病毒cDNA和宿主基因组的整合过程，过程分两部分完成，第一步是“3端加工”过程，在感染细胞的细胞质中进行，主要是选择性地将新的病毒cDNA切断产生黏性末端；第二步是“链转
4、移”过程，即将切断的病毒cDNA插入到宿主的染色体中，体外试验已证实了这个过程。-二酮酸类整合酶抑制剂的发现使将整合酶作为抗逆转录病毒的新靶点成为可能。现已有数个整合酶抑制剂经美国FDA批准进入临床试验，但是整合酶催化活性中心的氨基酸被取代则对整合酶抑制剂有了一定的耐药性，并且耐药菌株已被分离证实。对第一代整合酶抑制剂耐受菌株在临床上出现的可能性迫切要求我们尽快研发第二代的整合酶抑制剂。我们在对喹诺酮3羧酸类第一代整合酶抑制剂及其相似物的化学特性研究基础上建立药效基团模型，并根据模型筛选发现了具有良好活性且结构多样的先导化合物。II、研究方法：在研究方法上，文献主要采用基于配体相似性的虚拟筛选
5、药效基团搜寻方法，该类方法一般流程为小分子准备产生构象有活性分子生成药效基团假设优化、修改药效基团假设生成药效基团假设数据库搜寻。同时，在研究过程中也采用了一定的分子对接和视觉分析技术。III、研究过程、3-羧酸喹诺酮类药物药效基团研究：日本的Toacco发现了一系列的3-羧酸喹诺酮类化合物具有良好的整合酶转化抑制活性，通过充足的研究分析得出，3-羧酸喹诺酮类化合物的整合酶抑制活性主要在于若干关键药效基团的特性，包括羧酸官能团的阴离子特性，氢键受体和供体（包括NH或N上取代基）特性，二个疏水芳环结构以及脂肪酸链的疏水性。构效关系分析还指出在喹诺酮母核N上取代基的变化对于整合酶抑制活性影响很小，
6、而与抗逆转录病毒的活性关联性很高，原因可能在于母核N上取代基不参与与整合酶的结合，但是取代基对于分子的物理化学性质有很大的影响，从而对抗逆转录病毒的活性影响较高，因而我们在构建公共特征药效基团模型时不考虑母核N及其取代基的氢键供体作用和N上取代基的疏水活性。我们使用Catalyst软件包里面的HIPHOP方法产生公共特征药效基团假说。HIPHOP方法在原理上需要假定待测的一系列化合物以相似的构象结合在药物的结合位点上，并且与药物结合位点产生相类似的相互作用。我们选取五个3-羧酸喹诺酮类化合物作为训练集，对每个化合物Catalyst中的Poling算法产生各种可能的构象集群，HIPHOP模块分析
7、评价各个分子的构象集群和化合物的化学特性，产生了10个公共特征药效基团假设，均具有负离子（NI）官能团、氢键受体（HBA）、两个疏水性芳环（HRA）四个特性结构。更为细致的研究发现这10个药效基团假设中氢键受体的指向略有不同，而两个疏水性芳环的空间位置相似。HIPHOP根据模型与所有五个化合物关键化学特性的匹配程度评价打分。通过定量的研究各个模型之中药效基团之间的距离（图A）以及分析第一代整合酶抑制剂喹诺酮类化合物与模型的匹配程度（图B），选择最佳的模型用于后续的模型优化以及从小分子化合物库中筛选新化合物。其中选择过程为先选择评分最高的药效基团假设模建出三维药效基团模型，然后选择临床研究中的第
8、一代3-羧酸喹诺酮类整合酶抑制剂进行匹配，考察匹配情况。、化合物筛选利用HIPHOP分析、产生、优化之后的最优模型，从小分子化合物库中筛选出一定数量的化合物，并对结果化合物与药效基团匹配数值进行分析，选择与匹配数值较高的少量化合物（200个）作为下一步的待选化合物并对所有待选化合物在药效基团模型上的映射情况进行视觉分析，确保所有的化合物与药效基团的拟合情况合理，然后对所有的待选化合物测试其与整合酶活性位点的结合活性，通过分子对接技术预测化合物与整合酶活性中心结合时的空间位置和作用能并采用视觉分析方法分析确认预测结果，最终筛选出56个先导化合物进行体外的整合酶抑制活性评价试验。筛选的标准主要是化
9、合物的药效基团匹配数值、关键化学官能团在与模型匹配时的相对空间位置情况，同时将化合物与整合酶活性位点结合时的空间位置和与氨基酸残基之间的结合能情况作为另一条筛选标准。、研究结果、药效基团与对HIV-1病毒的整合酶催化活性关系通过对筛选得到的最后56个先导化合物进行体外酶活性试验，最终获得11个具有较好抑制整合酶催化“3加工”过程活性的化合物，并且其中有5个具有很好的抑制整合酶促进“链转移”过程的活性和良好的IC50值。对这5个化合物利用配体相似性采用2D药效基团搜寻方法搜寻结构类似物。其中在对化合物8的研究中发现化合物8的结构类似物均具有良好的抑制整合酶催化“3加工”过程活性以及抑制“链转移”
10、的活性，但是并不具备有十分优良的药效基团匹配数值而在筛选阶段被淘汰。另外，在对化合物8与整合酶活性中心进行分子对接研究（利用GOLD软件包）中发现药效基团模型特性与化合物8在整合酶活性中心的相互作用情况具有很好的相关性；通过X射线研究临床实验的整合酶抑制剂5-CITEP与整合酶核心结构域形成的受体复合物结构，发现化合物8在整合酶活性中心结合时的构象与5-CITEP形成的构象不相同（见下图A、B）。而在对其他四个化合物结构类似物的研究中也发现结构类似物具有的药效基团匹配数值与对整合酶活性抑制能力并无特定的关联性，同时，对抑制整合酶催化“3加工”过程的活性和抑制“链转移”过程活性的影响也随结构不同
11、也有所差别。据此可得知具有很好的药效基团匹配数值并不是一个化合物拥有良好的与靶位结合能力的先决条件。除了特定的构型约束极大程度决定了化合物的活性之外，整个化合物分子结构及官能团均对化合物与靶位的结合能力有一定的影响。化合物8的结构：（A） 化合物5-CITEP：（B）、细胞毒性和抗病毒活性情况对所有的先导化合物及其基于配体的相似性虚拟筛选的结果进行细胞毒性和抗病毒活性研究，包括在NIH3T3小鼠胚胎纤维原细胞细胞系中进行细胞毒性研究，以及MT-4人体T细胞系中进行抗HIV-1病毒活性评价，结果所有的化合物均无明显的细胞毒性，但是无有效的抗病毒活性。结论：通过建立一个四元的3羧酸喹诺酮类化合物的
12、药效基团模型成功筛选得到若干结构多样的有效整合酶抑制剂先导化合物，对活性化合物进行结构修饰可使具有良好的抗HIV-1病毒的活性。下面，我主要结合课本中的知识谈下自己对于这篇文献的理解。第一，该篇文献主要采用的基于配体相似性的虚拟筛选方法，通过对一组具有生物活性的化合物进行结构活性关系分析，找出共同的特征结构，然后通过软件产生若干关于药效基团的假设，利用软件的功能对各假设进行系统分析评价并建立三维的药效基团模型，结合活性分子对模型映射后的匹配情况综合决定最佳的药效基团模型用于后序的化合物库筛选。本文献采用的Catalyst软件利用最优的药效基团模型及来自受体的信息形成约束条件，对化合物库进行检索
13、并对化合物的活性进行评价。在获得先导化合物之后，利用视觉分析技术对先导化合物的结构合理性进行分析评价。在先导化合物活性测试后，利用配体相似性进行有较好活性先导化合物的结构类似物筛选，期望筛选得到更多有更好活性的先导化合物。在先导化合物获得的过程中，我们经常采用的方法可分为筛选方法和合理药物设计两种方法。筛选方法依赖于大量新化学实体，组合化学的引入极大的促进了新化学实体的合成，分子、细胞和整体动物水平筛选模型的建立有利于针对靶点采用合适的筛选方法，高通量筛选和高内涵筛选的发展使得筛选方法成为目前获得先导化合物的主要途径。而合理药物设计则避免了筛选方法的低命中率和盲目性，主要分为基于靶点、基于性质
14、和基于结构的药物设计方法，根据配体的或者受体的结构特征和理化性质寻找和设计合理的药物分子以达到选择性作用于靶点的有药理活性的先导化合物。而虚拟筛选方法则是两者的相互结合，通过在计算机上对化合物分子依据靶点或者配体的结构特征进行匹配达到初步筛选化合物的目的，然后对筛选结果进行实体的生物活性测试以获得有很好生物活性的先导化合物。虚拟筛选方法可分为基于靶点结构的虚拟筛选和基于配体相似性的虚拟筛选。文献中采用的是基于配体相似性的虚拟筛选，其中建立合理的药效基团模型是整个筛选过程的关键，在构建模型过程中利用软件产生若干药效基团假设并且通过合理的方法来评价各假设从中选择最佳的假设，再通过映像技术实现三维药
15、效基团模型的构建。在这过程中，药效基团假设的产生很大程度上受软件决定，分析筛选最合理的假设采用的方法也基本上是通过软件对各个假设产生的模型进行评分。因而，采用何种软件以及软件中提供的打分函数功能的优良与否成为整个筛选过程的关键。提高软件的性能以及完善评分函数是提高虚拟筛选命中率的途径之一。有文献报道指出HIV-1的整合酶的氨基酸序列、结合位点和活性中心的结构已经得到确定，那么可采用基于靶点的和基于结构的药物设计方法，也可采用基于靶点结构的虚拟筛选方法，这些方法可减少基于配体相似性的虚拟筛选方法中药效基团模型与实际靶点结构不匹配的可能性。虽然在本文献中，筛选得到了若干活性优良的先导化合物，命中率
16、也十分的出色，但是采用基于配体相似性的虚拟筛选方法潜在的风险性也是很大的。第二，文献最终的结论是基本无抗HIV-1病毒的活性，而其先导化合物中有若干个具有十分优良的抑制整合酶功能的活性，那么，究其原因，或许是由于先导化合物的物理化学性质并不十分优良，无法高效的进入细胞中发挥其抑制整合酶的活性而起到抗病毒的作用，而在研究过程中对第一代整合酶抑制剂的结构分析中也曾指出喹诺酮母核N上的取代基变化对抑制整合酶活性影响很小而对抗病毒活性影响明显，在一定程度上可作为一种参考证据。因而，可在后续的先导化合物优化中考虑引入脂肪链等因素改善化合物的透膜作用及其他物理化学性质，或者对3-羧酸喹诺酮类化合物进行基于
17、性质的药物设计，考察是否可以起到增强化合物的抗病毒活性。另外可通过结构修饰增强化合物分子的柔性，不仅有可能有利于增强化合物与整合酶活性中心的结合能力，也有望改变化合物的物理化学性质。不过，首要的是研究其无法产生抗病毒活性的原因，可利用放射性标记追踪化合物在HIV-1抗病毒活性测试过程进行分析。因为导致有抑制整合酶活性的先导化合物没有抗病毒能力的原因也可能是化合物分子稳定性差而在细胞中被降解或者无法进入整合酶活性中心。第三，据其他文献报道，要抑制整合酶活性，针对整合酶行使其功能的过程，可以寻找的化学切入点为：干扰核定位，阻断病毒DNA或者整合酶进入细胞核，抑制HIV与宿主染色体的整合；抑制整合酶
18、的多聚化，干扰酶单体之间的相互作用；抑制酶与底物DNA之间的反应；抑制整合酶的3位切割和链转移反应。目前已报道的整合酶抑制剂可归纳为几大类：二酮酸类化合物、核苷类抑制剂、肽类抑制剂、羟基取代的芳环化合物等。而其中以二酮酸及其化学等同体是目前确证了的真正在细胞内起抑制整合酶活性的化合物，主要起到抑制“链转移”过程的作用。在3-羧酸喹诺酮类化合物的进一步研究中或许可引入相应的二酮酸化学等同体的结构，也可对二酮酸类化合物进行药效基团模型构建，将获得的药效基团模型与3-羧酸喹诺酮类的药效基团模型进行对照综合分析，期望获得与整合酶活性中心多位点结合的药效基团模型，增强化合物与整合酶的结合能力，减少因活性
19、中心中若干氨基酸被替代而造成的耐药性的产生。另外，HIV整合酶抑制剂的研究中，现以抑制整合酶的3切割和链转移反应为切入点的研究较为广泛，而其他方向的研究则少有报道，希望可通过对整合酶行使功能过程的更为细致的研究，发现针对更多切入点的化合物，如针对干扰核定位、抑制整合酶的多聚化等，并利用拼合技术研究可同时作用于多个靶点的化合物。最后，从文献中我更加深刻的体会到在一个研究过程中可以发现更多值得研究的课题和可进一步加以研究的位点。在文献中，对于化合物8的研究叙述的很多，在文献中提到在对化合物8与整合酶活性中心分子对接研究中发现，化合物8结构中的苯亚甲基和苄氧基的结构占据了整合酶活性中心的空腔，而苯亚甲基的空间位置保证了酶抑制活性对其苯环的邻位和间位取代基有相当程度的容忍性，但对位的大位阻取代基则会引起空间相互作用影响与活性中心的结合能力。据此可推测对化合物8苯亚甲基环上的取代基进行优化能有望获得高整合酶抑制活性和良好物理化学性质的化合物。该点可为今后关于3-羧酸喹诺酮类化合物整合酶抑制作用的研究提供另一个研究位点和作为进行先导化合物优化的理想底物。
