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1、金银花和金银花露中绿原酸和4种黄酮含量的测定 金银花为忍冬科多年生半常绿缠绕植物忍冬的花蕾及初开的花，又名忍冬花、银花、双花等，其主要成分有机酸绿原酸具有抗菌、抗病毒及抗真菌、增强机体防御机能的作用，也是鉴定金银花品质的标准。同时金银花中含有木犀草素、金丝桃苷、槲皮素、芹菜素等多样黄酮类化合物。现代医学研究表明，黄酮类化合物具有降低心肌耗氧量，使冠脉、脑血管流量增加，软化血管，降血糖、血脂等作用。同时黄酮还是一类天然的抗氧化剂，具有抗衰老，增加机体免疫力的生理活性作用。鉴于此，金银花中黄酮的含量也可以作为金银花品质检验的标准。目前对以上这5种物质已经建立的分析方法已经有：阻抑催化褪色光度法 、
2、分光光度法、高效液相色谱法、共振瑞利散射光谱法、催化动力学光度法、流动注射化学发光法、毛细管电泳法等但文献中多为一种或两种物质的测定，而同时对金银花中绿原酸和黄酮类化学物进行测定的报导还未曾出过。本文则建立了一种反相高效液相色谱法同时对绿原酸、金丝桃苷、木犀草素、槲皮素、芹菜素进行测定，旨为增加对金银花质量检测的补充。 1 实验部分1.1 仪器与试剂 Agilentl100高效液相色谱仪(美国，Agilent公司)；DF一101s集热式恒温加热磁力搅拌器(中国，郑州 长城科工贸有限公司)；DZF一6021真空干燥箱(中国，上海齐欣科学仪器有限公司)；pHs一3c酸度计(中国， 成都世纪方舟科技
3、有限公司)绿原酸、金丝桃苷对照品(98%)，槲皮素对照品 (98%,中国药品生物制品检定)，木犀草素对照品(99%,中国药品生物制品检定),芹菜素对照品。甲醇(分析纯)、磷酸(分析纯)、金银花样品(购于重庆市)和金银花露(每 500 mL相当于金银花31.25 g)。水为二次蒸馏水。1.2 实验方法1.2.1 色谱条件 Eclipse XDB-C8柱(4.6150 mm，5mm)；流动相为甲醇-水(用磷酸调节pH-2.60)。采用梯度洗脱,检测波长340 nm；流 速0.8 mLmin；进样量为20uL。1.2.2 标准曲线的绘制 分别精密称取干燥至恒重的绿原酸、槲皮素、木犀草素和金丝桃苷对照
4、品适量加甲醇溶解制成1.0 g/L的贮备液，芹菜素用热的乙醇溶解制成1.0 g/L的贮备液。临用前用贮备液配制一系列不同浓度的5种标样的混合溶液进样20uL,以各组分峰面积y对其质量浓度X(g/L)进行线性回归分析，得到的回归方程、相关系数、线性范围及其检测限。1.2.3 样品含量测定精密称取金银花试品粉末(过60目筛)2.000g，置圆底烧瓶中，加30 mL 70%乙醇(磷酸调pH- 26)，于86水浴回流1h，过滤，滤渣加2OmL 7O%乙醇(磷酸调pH-2.6)，重复上述步骤两次，合并3 次提取液，放冷，转移到100 mL容量瓶，稀释至刻度，摇匀，取2.5 mL稀释至100 mL，用0.
5、45 m微孔 滤膜过滤，作为供试品溶液1；取金银花露1 mL稀释至10 mL作为供试品溶液2，按2.1色谱条件分析，外标法计算含量。1.2.4 精密度实验 取同一浓度对照品溶液，重复进样5次，测得峰面积，计算得绿原酸的标准相对偏差(RSD)为 2.8 96，金丝桃苷的RSD为1.4 ，槲皮素的RSD为2.O，木犀草素的RSD为1.1 9/6表明该方法的精密度良好。1.2.5 重复性实验 按照23项下样品的预处理过程分别同时处理金银花样品5份，测得绿原酸含量的RSD为1.69%；金 丝桃苷含量的RSD为2.4 ；槲皮素含量的RSD为2.1；木犀草素含量的RSD为1.8%。表明该方法的重现性良好。
6、1.2.6 加样回收实验 精密量取已知含量的金银花试液5份，分别精密加入绿原酸、金丝桃苷、槲皮素和木犀草素对照品，测定样品的平均加标回收率。1.2.7 稳定性实验取同一样品溶液，分别于0、4、8、12、24 h进样测定，绿原酸的RSD为0.87 ，金丝桃苷的RSD为 0.63% ，槲皮素的RSD为0.95% ，木犀草素的RSD为0.77% ，表明样品在24 h内基本稳定。待添加的隐藏文字内容32 结果与讨论2.1 流动相的选择 黄酮类成分在HPLC测定中易出现拖尾现象，在流动相中加入磷酸，抑制其拖尾，提高峰形对称性。通过对不同比例的有机相及磷酸浓度的实验选择，结果发现甲醇-水(磷酸调pH-26
7、)系统比乙腈-水(磷酸调pH-26)系统分离效果好，故选择甲醇-水(磷酸调pH=26)为流动相。并根据这5种物质的极性和分离情况，调整流动相的配比，采用梯度洗脱。2.2 实验测定波长的选择 扫描各对照品在200700 nm范围内的紫外吸收光谱，分析结果，实验选择在330，340，350，360nm 处对混合样测定，比较发现在340nm处所测定的峰面积相对较大，灵敏度较高，峰形较好，因此本实验采 用340nm作为测定波长2.3 样品处理方法的选择 金银花样品分别用水浴回流提取与超声提取处理，结果发现水浴回流法提取的金丝桃苷、槲皮素和 木犀草素的总含量比超声法的高出一倍，因为回流更有利于苷的水解，实验比较选定磷酸缓冲，V (磷酸)：V(乙醇)-30：70水浴回流提取的方法。3 结 论 文献中的高效液相色谱法的测定结果线性范围窄，灵敏度低；而其他方法也存在一定的不足，如：分光光度法选择性较差，质谱法对仪器的要求很高、价格昂贵，化学发光法和催化动力学光度法操作手续烦 琐等而本文运用反相高效液相色谱法对绿原酸、金丝桃苷、木犀草素、槲皮素、芹菜素同时测定，此法简 便，快速准确，灵敏度高，重现性和稳定性良好，可用于金银花的品质检测。
