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1、药物毒理学实验指导南方医科大学药学院实验中心二0一0年八月目 录实验一、药物急性毒性实验（LD50测定）实验二、急性肺损伤实验实验三、药物免疫毒性试验实验四、小鼠骨髓细胞微核试验实验五、小鼠精子畸形实验实验六、药物生殖毒性实验实验一 急性毒性试验盐酸二甲弗林（回苏灵）LD50测定一、实验目的 化学物急性毒性试验是研究化学物毒性效应的基本试验。本实验的目的是学习急性毒性试验的实验设计、实验原理和实验操作方法。二、基本原理选择健康的实验动物，根据体重按随机分组的方法，依据LD50计算的设计原料则将动物分成数个染毒组。一次或24h内多次给予受试物后，观察动物所产生的急性毒性反应及其严重程度，中毒死亡
2、的情况等，根据各组动物死亡数计算半数致死量（LD50）。据此分析受试物毒性反应与剂量的关系，并根据LD50值对化学物进行毒性分级。三、实验材料1、器材 1ml注射器、烧杯、电子天平、苦味酸、镊子、剪刀、酒精棉球等。2、药品 0.4回苏灵注射液（经预试验后按比例稀释）。3、动物 健康成年小白鼠若干只，体重18-22g，雌雄各半。四、实验方法1、预试验 （1）探索剂量范围：先找出100%与0%的致死量为实验的上下限剂量，即Dmax和Dmin。取动物若干，每4只一组，按估计量给药，如出现4/4死亡时，下一组剂量降低，当出现3/4死亡时，则上一剂量为Dmax；如降低一剂量出现的死亡率2/4或1/4时，
3、应考虑到4/4死亡剂量组在正式实验时可能出现死亡率低于70%，为慎重起见可将4/4死亡剂量乘以1.4倍，作为Dmax。同法找出Dmin。（2）确定合适的剂量分组方案：组数（n）以5-8组为宜，根据下面公式计算组间剂量公比r。r=1/各组剂量分别Dmax、(Dmax) r、(Dmax)r2、(Dmax)r3。2、正式试验 （1）动物的称重、编号和分组： 每组10只动物（雌雄各半），随机分组和用苦味酸编号。（2）受试物的配制： 根据预试验得出Dmin为4.0mg/kg，Dmax为8.0mg/kg，分为5个剂量组，根据公式计算r0.85。配制时取第一个剂量组17ml加生理盐水3.0ml（按1：0.8
4、5稀释）作为第二个剂量组，依此类推配制其它剂量组。（3）给药： 本次试验是用腹腔注射方法给药，0.2ml/10g体重。（4）观察：给完受试物后即刻观察和记录30min内动物反应，包括一般活动情况、中毒体征、死亡前的特征、死亡动物数、死亡时间。五、结果记录1. 描述动物中毒和死亡反应的特征。2. 参照下表和改良寇氏法的计算方法，计算回苏灵的LD50。 表1. 急性毒性实验结果列表剂量（mg/kg）对数剂量（X）动物数 （只）死亡数（只）死亡率（p）存活率（q）pq4.184.915.786.808.000.6210.6910.7620.8320.903101010101002571000.20.
5、50.71.01.00.80.50.3000.160.250.210i=0.07p=2.4计算公式如下：Lg(LD50)= Xmi（p0.5）Xm=最大剂量对数值P=动物死亡率p=各组死亡率的总和i=相邻两组剂量比值的对数（高剂量做分子）将数据代入公式，经计算得回苏灵注射液LD50=5.87mg/kg实验二 急性肺损伤实验一、实验目的通过比较染毒动物与正常动物肺脏重量和形态的变化，学习评价外源性化学物急性肺损伤的基本方法。二、基本原理肺脏组织结构疏松，血流丰富，化合物引起的急性肺损伤以渗出、水肿和出血为主，通过比较肺形态、肺重量和肺灌洗液的变化，可以反应急性肺损伤的严重程度。三、实验材料1、器
6、材 1ml注射器、5ml试管，电子天平、苦味酸、镊子、剪刀、止血钳、硫酸纸等。2、药品 生理盐水、含4油酸和16%二甲基亚砜(DMSO)的生理盐水混悬液。3、动物 健康小白鼠，体重18-22g，雌雄各半。四、实验方法1给药方法动物称重，样品用注射器反复抽吸混匀后，以0.1ml/10g体重尾静脉注射。对照组尾静脉注射等剂量生理盐水。2.观察（1）小鼠尾静脉注射油酸后，观察一般状况、呼吸频率、呼吸深度等变化。（2）肺形态和肺重量变化：注射后30分钟，小鼠处死，剖开胸腔,剪开颈部皮肤,分离皮下组织,于甲状软骨下缘夹住气管后分离出肺脏，观察油酸组和对照组的小鼠肺脏外观形态变化，如肿胀、充血、渗出等，并
7、称取肺重量。（3）肺灌洗：从气管注入1ml生理盐水，回抽的灌洗液注入刻度试管内，重复2次，观察灌洗液的外观和体积。五、结果记录1. 统计各组计算肺灌洗液容积的。2. 根据以下公式计算肺系数：肺系数=肺重/体重100%，并计算其。3. 将肺系数和肺灌洗液容积的计算结果，以及肺脏和灌洗液的外观变化填入下表。肺系数和灌洗液容积进行组间t检验。组别肺脏肺灌洗液（BALF）外观肺系数外观容积 (ml)对照组油酸组t值P实验三 药物免疫毒性试验（环磷酰胺对小鼠免疫器官重量的影响）一、实验目的 通过比较染毒动物与正常对照动物胸腺和脾脏的大小和重量差异，学习评价外源性化学物对动物免疫器官毒性的基本方法。二、基
8、本原理 环磷酰胺是影响DNA结构与功能的周期非特异性抗肿瘤药，可阻碍DNA的复制，破坏细胞的有丝分裂，对快速增殖的细胞杀灭作用尤为突出。因此，环磷酰胺可显著抑制动物免疫器官的细胞增殖，引起免疫器官重量减轻。三、实验材料1、器材 1ml注射器、手术剪、眼科剪、眼科镊、电子天平、苦味酸、止血钳、硫酸纸等。2、药品 环磷酰胺注射液、生理盐水。3、动物 昆明种小白鼠，体重18-22克，雌雄各半。四、实验方法1、染毒 取昆明种小白鼠20只，雌雄各10只，随机分成实验组和对照组，每组雌雄各半。实验组腹腔注射1环磷酰胺注射液0.1ml/10g（100mg/kg）体重，对照组腹腔注射生理盐水0.1ml/10g
9、体重，每日一次，连续给药四次。2、标本的采集 最后一次注射24小时内，颈椎脱臼处死动物，称体重。将小鼠仰卧固定于解剖板上，沿腹中线剪开腹部，在左上腹部取出脾脏; 取胸腺时，应在胸部正中偏开约0.5cm处剪开胸壁，以避免剪坏胸腺。分离胸腺和脾脏时，应将其周围脂肪等组织清理干净，并立即称重。五、结果记录 根据公式：胸腺系数=小鼠胸腺质量（mg）/小鼠体质量（g）, 脾脏系数=小鼠脾脏质量（mg）/小鼠体质量（g），分别计算两组动物的胸腺系数和脾脏系数()，填入下表，进行组间t检验。分析实验结果，写出实验报告。表一，环磷酰胺对小鼠胸腺和脾脏重量的影响（XSD，n=10）胸腺系数脾脏系数对照组实验组t
10、值P实验四 小鼠骨髓细胞微核试验一、实验目的 通过本次实验，学习和了解小鼠骨髓多染红细胞（PCE）微核实验基本方法。二、基本原理 微核是细胞内染色体断裂或纺锤丝受到各种理化因素的影响，在细胞有丝分裂后滞留在细胞核外的染色体物质。微核大小相当于细胞直径的1/201/5，呈圆形或杏仁状，其颜色与细胞核一致，在细胞中可以出现一个或多个。微核试验是用于染色体损伤和干扰细胞有丝分裂的化学毒物的快速检验方法。各种类型的骨髓细胞都可形成微核，但有核细胞的胞质少，微核与正常核叶及核的突起难以鉴别。嗜多染红细胞是分裂后期的红细胞由幼年发展为成熟红细胞的一个阶段，此时红细胞的主核已排出，姬姆萨染色呈灰蓝色，成熟红
11、细胞呈淡桔红色。骨髓中嗜多染红细胞数量充足，微核容易辨认，因此，骨髓中嗜多染红细胞成为微核试验的首选细胞群。三、实验材料1. 器材 手术剪、镊子、弯止血钳、纱布、注射器、载玻片、计数器、电吹风、带油镜头显微镜、100ml烧杯、染色缸等。药品与试剂 用生理盐水配制成1环磷酰胺注射液（10mg/ml）、生理盐水、小牛血清、Giemsa储备液、pH6.8的磷酸盐缓冲液、甲醇。3动物 小鼠体重1822g，每组10只，雌雄各半。四、实验方法1. 染毒 给小鼠腹腔注射1环磷酰胺，每0.1ml/10g体重（100mg/kg），每日一次，连续给药两次。注射生理盐水为阴性对照组。2骨髓液的制备和涂片 在最后一次
12、染毒24h内用颈椎脱臼方法处死动物，将小鼠仰卧固定于解剖板上，沿腹中线剪开腹部，在胸部正中偏左或偏右约0.5cm处剪开胸壁，取下胸骨，擦净血污，剔除肌肉，剪去骨骺，用小弯止血钳将骨髓挤于有一滴小牛血清的载玻片上，混合均匀后推片。也可用双腿股骨骨髓细胞进行涂片，方法是取下股骨，剔去肌肉，用生理盐水洗去血污和碎肉，剪去两端的骨骺，用带针头的2ml注射器吸取小牛血清，插入骨髓腔内，将骨髓冲入离心管，然后用吸管吹打骨髓团块使其均匀，以1000r/min离心10min，弃去多余的上清液，留下约0.5ml与沉淀物混匀后，用滴管吸取并滴一滴在载玻片上，推片。3固定与染色 将推好晾干的骨髓片放入染色缸中，用甲
13、醇溶液固定15min，取出晾干后放入新鲜配制的Giemsa应用液中染色1015min，然后冲洗掉玻片上的染色液，晾干。4观察计数 先在低倍镜下进行观察，选择分布均匀，染色较好的区域，再在油镜一下观察记数，PCE细胞呈灰蓝色，正染红细胞（NCE）呈橘黄色。细胞中含有的微核多数呈圆形，边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色。若一个嗜多染红细胞中出现两个或两个以上微核，仍按一个有微核细胞计数。计数1000个PCE细胞中含微核的PCE数，并计数200个细胞中PCE与NCE的比值。五、结果记录1. 描述微核的形态特征。2. 计算各组微核细胞率。实验五 小鼠精子畸形实验一、实验目的掌握观察和评价
14、精子畸形的基本方法。二、基本原理精子畸形是生殖细胞基因发生突变的结果。小鼠精子畸形试验能评价受试物对精子生成、发育的影响，可检测受试物在体内对生殖细胞的遗传毒性作用。三、实验材料1. 器材 生物显微镜、解剖剪、镊子、表面皿、离心管、小漏斗、吸管、滴管、载玻片、擦镜纸、纱布、注射器、计数器、电吹风、染色缸等。药品与试剂 用生理盐水配制成0.4环磷酰胺注射液（4mg/ml）、生理盐水、1%伊红染色液、甲醇。3动物 性成熟成年雄性小鼠。四、实验方法1环磷酰胺40mg/kg腹腔注射，连续5天，每日一次。对照组为注射等剂量生理盐水。2制片：用颈椎脱臼法处死小鼠，剖开腹腔，暴露睾丸，分离两侧附睾，用眼科剪
15、剖开附睾组织，与适量生理盐水混匀，涂片。3. 固定：待涂片干燥后，放入甲醇（A.R）液中固定5min。取出晾干。4. 染色：将涂片于1%伊红染液中染色1h，然后用蒸馏水轻轻冲洗，晾干。5. 观察与计数：首先，在低倍镜下选择背景清晰、精子分布均匀、重叠较少的区域，然后，在高倍镜下观察结构完整的1000个精子，计数其中畸形的精子。精子畸形主要表现在头部。主要类型有：无钩、香蕉形、无定形、胖头、尾折叠、双头及双尾。无尾精子、头部重叠的或整个与另一个重叠的精子均不计数。判断双头、双尾精子时，要注意与两条精子的部分重叠相区别。五、结果记录1. 描述精子畸形的形态特征。2. 计算各组精子畸形的发生率。实验
16、六 药物生殖毒性实验一、实验目的掌握观察胎鼠结构异常的方法，了解药物致畸作用评价的基本方法。二、基本原理药物的对生殖细胞和胚胎发育的毒性作用可导致不育、流产和畸胎的发生。 观察受精后母鼠的受孕率、死胎、畸胎等，可以评价药物的生殖、发育毒性。三、实验材料1. 器材 生物显微镜、解剖剪、镊子、纱布、注射器等。2. 药品与试剂 用生理盐水配制成0.4环磷酰胺注射液（4mg/ml）、生理盐水。3动物 性成熟成年小鼠，雌雄各半。四、实验方法1性成熟小鼠按雌鼠和雄鼠1：1同笼3天，每日环磷酰胺40mg/kg腹腔注射。3日后，取出雄鼠。同笼后第10天，雌鼠环磷酰胺40mg/kg腹腔注射，连续3天。第20 d 孕鼠处死，并进行检查。对照组为注射等剂量生理盐水。2取出子宫检查活胎和死胎数3. 活胎鼠检查：记录胎鼠体重、体长、尾长、检查胎鼠外观有无异常，如头部有无脑膨出、露脑、小头、小耳、小眼、无眼和睁眼、兔唇、下颌裂，躯干部有无腹壁裂、脐疝、脊柱弯曲，四肢有无小肢、短肢、并趾、多趾、无趾等畸形，尾部有无短尾、卷尾、无尾、肛门有无闭锁。五、结果记录1.计算各组小鼠活胎和死胎的发生率2.描述畸胎形态特点，分类计算各种畸胎的发生率
