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1、毕业论文加减三黄汤对感染耐药大肠杆菌鼠IL-2、IL-6 和NO的影响The Effects of IL-2, IL-6 and NO from mose effected Resistance E.coli by Modified Three Yellow Soups姓 名： 指导教师： 院 系：动物科技学院动物医学系专 业：动植物检疫年 级：2007级动植物检疫本科班论文提交时间：2011年6月9日目录引 言- 3 -1 材料与方法- 4 -1.1 材料- 4 -1.1.1 试验药品- 4 -1.1.2 试验菌株- 4 -1.1.3 仪器设备- 4 -1.1.4 试验动物- 4 -1.2
2、方法- 4 -1.2.1 试验菌液的制备- 4 -1.2.2 抑制剂配方的制定及提取物的制备- 5 -1.2.3 最小抑菌浓度（MIC）的测定- 5 -1.2.4 中药抑制剂与耐药性大肠杆菌使用量的确立- 5 -1.2.5 分组与模型制作- 5 -1.2.6 相应测定体重变化胸腺、脾免疫器官指数- 5 -1.2.7 组织匀浆制备，血清及组织匀浆因子检测 NO试剂盒检测免疫力- 6 -1.2.8 统计结果，确定中药组方疗效- 7 -2 结果- 7 -2.1 中药抑制剂在机体中最佳使用剂量- 7 -2.2 耐药大肠杆菌最佳攻毒量- 7 -2.3 实验期间各组死亡情况与疗效结果- 7 -2.3.1自
3、然死亡情况- 7 -2.3.2疗效- 8 -2.4各组小鼠免疫器官指数的测定结果；- 8 -2.5 血清及组织细胞因子检测- 8 -2.5.1 NO对小鼠免疫功能的影响- 8 -2.5.2白介素2对鼠免疫功能的影响- 9 -2.5.3 白介素6对鼠免疫功能的影响- 9 -3讨论- 9 -3.1 讨论- 9 -3.1.1促进机体免疫器官的发育，提高机体免疫力- 9 -4结论- 10 -参考文献- 11 -致谢- 12 -加减三黄汤对感染耐药大肠杆菌鼠IL-2、IL-6和NO的影响范建超动物科技学院 07级动植物检疫专业本科班指导教师：尹秀玲中文摘要：目的：探讨加减三黄汤对多重耐药性大肠杆菌病的影
4、响。方法：确定加减三黄汤（2g/ml）对高度耐药的人源2952(O142+O26+O13)菌株的接种量以原液的0.5ml（2.4109CFU）。选取健康的30只小白鼠，随机分为健康组，阳性对照组和攻毒治疗组。自感染试验菌第1天起，试验组每只小鼠每天分别灌服中药制剂提取物0.5ml，连续7d。在感染后第8d，随机抽取测定生化指标，剖检测定免疫器官指数，血清及组织细胞因子IL-2、IL-6、NO含量。结果：加减三黄汤对人工感染耐药E.coli后可以显著提高血清及组织因子IL-2的含量，NO的含量影响肝脾的恢复。结论：加减三黄汤对,多重耐药性大肠杆菌能起到一定的耐药逆转作用，对动物机体具有一定的免疫
5、保护作用。关键词：耐药性大肠杆菌， IL-2，IL-6，NOThe Effects of IL-2, IL-6 and NO from mose effected Resistance E.coli by Modified Three Yellow SoupsFan Jianchao(animal and plant quarantine, College of Animal Science and Technology ) Guide Teacher: Yin Xiuling Abstract : Objective: The effect of Modified Three Yellow
6、Soups(MTYS) by modified was investigated on multidrug resistant E.coli. Methods：the 2g/ml inoculum of multiple drug resistance to No. 10 E. coli was determined and inoculated by 0.5ml (2.4 109CFU) In vivo test. The 30 mouse were randomly arranged into 3 groups, the positive control and experiment gr
7、oup were inoculated with the 0.5ml extractive of MTYS each day for seven days. After the eight days, some slikies fowl were randomly taken from each group for detecting blood serum biochemical indicator , immune organ index and the content of Serum and organization of cytokines IL - 2, IL-6 and NO,.
8、 Results: MTYS had very obviously effect on varying degrees of increase in immunity. IL-2 levels and NO content were increase significantly of serum and tissue factor,then effect the recovery of the liver and spleen. Conclusions: MTYS had obviously inhibitory effect to resistant multidrug E.coli and
9、 immunoprotection on creature.Key words: the resistant E.coli isolated from mouse ; inhibitor; biochemical indicator; IL-2, IL-6 and NO引 言大肠杆菌是畜禽的重要致病菌，随着大肠杆菌耐药株的不断增多，大肠杆菌感染及其食品污染有不断上升的趋势，尤其是人类食物中毒和胃肠炎的不断暴发已成为全球关注的焦点，因此，控制耐药菌的传播和防治细菌感染己成为一个世界性难题。在细菌性疾病中大肠杆菌是兽医临床感染中的常见病原菌, 其病原抗原较复杂，在临床上表形症状和剖检病理变化也较多
10、，给养殖业带来了重大损失。自从1940年青霉素问世以来，很多抗生素在各种常见细菌性疾病的治疗中发挥了重要的作用。但随着抗生素的广泛应用，越来越多的病原菌产生了耐药性，而且耐药性严重。尤其大肠杆菌对青霉素类（青霉素耐药率为99.05%）、大环内酯类（红霉素耐菌率为79.72%）、氨基糖苷类（链霉素耐菌率为48.98%，庆大霉素耐菌率为43.88%）、诺酮类（氧氟沙星耐菌率为37.76%）耐药性都很高1-2。如果对大肠杆菌耐药性处理不好，发展成超级菌，那将对感染畜禽的治疗将带来很大的困难。目前对多重耐药性大肠杆菌抑制剂的研究已有很多报道，但对抗耐药性大肠杆菌中药抑制剂的研究报道较少。我国有着得天独
11、厚的中药资源，中药在治疗感染方面显示了独特的作用，同时中药具有资源丰富、作用靶位多、毒副作用较小、价格便宜及体内使用安全等优点。中草药的活性成分可抑制耐药性大肠杆菌主动外输系统，使耐药性大肠杆菌消除其耐药性3-4。本试验以耐药机制清楚、致病作用强的人源性大肠杆菌作为研究对象，利用以黄连、黄芩、黄柏清热解毒为主的中药三黄汤，佐以大黄清热兼能活血散瘀，共达清热解毒、活血散瘀的功效5。以芩柏龙胆散治疗大肠杆菌病模型鼠，结果该方剂可有效降低大肠杆菌病的死亡率，缓解其内脏病变的程度，保护病鼠的精神和食欲，加速康复过程，来消除其多重耐药6-7。据报道，中药的活性成分能够明显抑制耐药大肠杆菌的外输系统，对R
12、质粒具有明显的消除作用8。通过对传统中药三黄汤加减配成不同组方，观察体外抑菌效果，筛选出能够抑制大肠杆菌药物耐药性的抑制剂，来消除其多重耐药。通过探讨其对不同耐药程度的大肠杆菌的影响，选取有效药物进行合理组方，通过与抗生素联合增敏试验，确定最佳组方。然后对中药组方作用于感染大肠杆菌鼠前后血液生理生化指标检测，分析中药组方对机体的保护作用，从分子生物学角度研究药物对大肠杆菌的作用机制，本实验先通过在体外对人源大肠杆菌进行临床分离细菌鉴定、分离培养、血清型鉴定和耐药性检测，然后再将分离鉴定的菌株回归到动物体内，对小鼠的免疫力进行检测，获取有效组方应用于临床，可为该病今后防治提供一定依据。1 材料与
13、方法1.1 材料1.1.1 试验药品 黄连、厚朴、苦参、大青叶、穿心莲、黄芩、黄柏、木香、甘草、黄芪、茯苓、均购自张家口医药公司。营养肉汤 北京海淀区微生物培养基制品厂生产。麦糠凯琼脂 北京陆桥技术有限责任公司生产。1.1.2 试验菌株 经临床分离9生化鉴定的人源大肠杆菌进行血清型鉴定，获得致病性高度耐药的人源2952(O142+O26+O13)菌株。（北京天坛生物制品检定所鉴定，本室保存）。1.1.3 仪器设备 旋转蒸发器、LDZX-40B1型不锈钢立式自动电热蒸汽压力灭菌器、SZX-01型超静工作台、SKP-01型电热恒温培养箱、电子天平、微量加样器、爱林牌WZRX1微量吸液器 苏州市东吴
14、医用电子仪器厂，Cap-Ria 16 GAMMA COUNTER 美国产，FT-614混匀器 核工业部，北京和仪器厂，HH-W21-420BS电热很温水浴箱，上海跃进医用光学器械厂，541-10000-00-0 HEIDOLPH 振荡器 REAX top Glasblasreei-Krankenhausbedarf laboreinrichtungen. Hassa Laborbedarf 24 200 anthos fluido 洗板机，anthos labtec instruments 128c 酶标仪 Clinibio。1.1.4 试验动物 100只小白鼠 购自河北北方学院附属实验牧场。
15、1.1.5 试剂 碘125I白细胞介素-2放射免疫分析药盒说明书 北京普尔伟业生物科技有限公司 碘125I白细胞介素-6放射免疫分析药盒说明书 北京普尔伟业生物科技有限公司 血清因子IL-2、IL-6、NO试剂盒购自上海沪峰试剂有限公司。1.2 方法1.2.1 试验菌液的制备 将分离并筛选人源性大肠杆菌菌株10进行复苏培养18h24h。在无菌操条件下，吸取20ul菌液，接种于含2.0ml营养肉汤培养基试管中，按10-1、10-2、10-3、，十进位稀释，置37培养。每种菌株做两个重复。采用显微镜直接计数法进行活菌计数，配成约含菌量为109CFU/ml的菌悬液。1.2.2 抑制剂配方的制定及提取
16、物的制备 根据传统中药理论和配伍原则及三黄汤配方进行加减，制成如下配方：中药制剂（MTYS）黄芩12g、黄连12g、黄柏12g、穿心莲9g、苦参9g、金银花15g、大青叶15g、木香6g、甘草9g、厚朴9g、黄芪9g、茯苓9g，水煎剂。1.2.3 最小抑菌浓度（MIC）的测定 采用试管两倍稀释法，对所制备的中药MTYS提取物需先测定其对该菌株的MIC值，细菌接种量约为109CFU/ml，同时做阴性、阳性对照，每一浓度药液做两个平行，以平均值为最终结果。同时将各培养细菌划线接种于相同中药浓度营养琼脂培养基上，再次观察各菌株的药敏试验结果并记录。判定标准为：无大肠杆菌生长的最小药液浓度为该药物对该
17、菌株的最小抑菌浓度（MIC）。1.2.4 中药抑制剂与耐药性大肠杆菌使用量的确立 1.2.4.1 中药抑制剂在机体中使用剂量的确立 取30只体重均匀的小白鼠，随机分为6组，每组5只，各组小鼠分别灌服不同计量的MTYS 中药提取物，1次/d，用药期7d，停药2d，第8天称其体重，求其平均值。每天观察每组小鼠的采食、饮水、行为及死亡情况，并对精神沉郁的小鼠和死亡的小鼠进行剖检和细菌培养，以确定MTYS的用药量。1.2.4.2 耐药大肠杆菌最佳攻毒量的确定 取60只体重均匀的小鼠，随机分成3组，每组20只，按组分别腹腔注射不同剂量人源2952(O142+O26+O13)菌株菌液，每天观察每组小鼠的采
18、食、饮水、行为及死亡情况，观察10d，死亡小鼠作病理剖检和菌检，确定死亡原因，最后计算死亡率。1.2.5 分组与模型制作 健康小白鼠60只，常规饲养7d后随机分为7组，分别编号：健康组A组、攻毒2952组B组、攻毒2952+MTYS组C组每组20只，除A组外，其余组按每只小鼠腹腔注射试验菌液0.2ml（约含菌1.6109CFU）进行攻毒，A组腹腔注射生理盐水0.2ml。自造模第1天起，A、B组每日上午10：00灌服生理盐水0.5ml，C组灌服浓缩为1g/ml的MTYS浸提制剂0.5ml，连续7d。 1.2.6 相应测定体重变化胸腺、脾免疫器官指数 攻毒喂药后第8d，分别从各组小鼠群中空腹称重，
19、统计MTYS对小鼠增重的影响，然后屠宰，摘取胸腺、脾称重，计算其免疫器官指数（免疫器官重宰前空腹活重100），即以免疫器官的克数占千克体重的份额（g/kg）表示。各组小鼠在感染前和试验结束时分别称重1次，测定胸腺、脾重，根据小鼠的体重变化，计算每组小鼠的平均体重和标准差11。1.2.7 组织匀浆制备，血清及组织匀浆因子检测 NO试剂盒检测免疫力 按照说明书方法，鼠(mouse）一氧化氮（NO）ELISA检测试剂盒：样血清操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000g离心10分钟将血红细胞迅速小心地分离。组织匀浆将组织加入适量生理盐水捣碎。1000g 离心10分钟
20、，取上清液。操作：使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。加入稀释好后的标准品50u1于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50u1的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37温育45分钟。甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。每孔加入100u1的亲和链酶素一HRP，轻轻振荡混匀，37温育30分钟。甩去孔内液休
21、，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。每孔加入底物A, B各50u1，轻轻振荡混匀，370温育5分钟。避免光照。取出酶标板，迅速加入50u1终止液，加入终止液后应立即测定结果。在450nm波长处测定各孔的OD值12。 IL-2、IL-6试剂盒检测免疫力： 血清：取静脉血2m1,注入试管待凝固后，4 3000rpm离心，10min,分离血清。放-20，样品可保存2个月，放-70以下可存放半年。测定前使样本置于室温或冷水中复融， 再次403000rpm离心，5 min,取上清测定。注：测定兔血浆时，应改用25PEG 500p1作
22、分离剂，离心前NSB、S0 、S1-S6管补加球蛋白100l,样品管加PBS各100l ,然后再加25 % PEG 500l。测兔血清时最好每个标本做一个U0 ,25PEG和球蛋白由我公司提供。 组织：取出活组织，吸去血迹，称重，尽快加入生理盐水1ml碾磨，制成匀浆，43000rpm离心，15min,取上清，-20以下保存。测定前最好做预实验确定样品稀释度。取3-5份做小样，可将样品做原倍，1：5，1：20倍稀释，选择合适的稀释度。 另外，每种组织的样品非特异结合（U0）可能有些差异，每份标本最好申独做一个Uo或每组做一个U0。取组织的重量一般在300-400mg左右为好。 细胞培养液或其它体
23、液：如样品浓度高，可直接加样测定，如浓度低需将样品浓缩5-10倍，再加样测足，可取样品0.5ml，加入测量用的放免塑料管中再冷冻干燥机上冷冻抽干，用0.1 ml生理盐水复融，做为样品管直接测定。 本实验采用平衡法，取聚苯乙烯试管编号，按下表操作。 IL-6 RIA加样程序（l）PR分离剂一 500 500 500 500 500充分混匀，室温放置20min, 4 3500rpm离心25min,吸弃上清，测个沉淀管，cpm数。鸡IL-2试剂盒检测同上，在河北北方学院一附院检验科测定。 1.2.8 统计结果，确定中药组方疗效 所有实验数据均用t检验软件进行分析，计量资料以 s表示，并进行t 检验分
24、析。2 结果2.1 中药抑制剂在机体中最佳使用剂量 为了在体内试验时，中药MTYS提取物的浓度能够在体内达到一定的药物浓度，又不影响机体的正常发育，中药MTYS的使用剂量，每只小鼠以2g为宜13。2.2 耐药大肠杆菌最佳攻毒量 耐药性大肠杆菌人源2952(O142+O26+O13)菌株每只小鼠的接种量以原液的0.5mL（2.4109CFU）为宜。2.3 实验期间各组死亡情况与疗效结果2.3.1自然死亡情况 在攻毒前对随机抽取的小鼠在无菌条件下剖检观察和细菌培养，没有发现感染大肠杆菌。说明，人工造模是在没有感染大肠杆菌的前提下进行的。在人工病模试验，治疗组和细菌感染组小鼠在攻毒后8小时，部分小鼠
25、出现不同程度的大肠杆菌临床症状，主要表现为精神不振，轻度腹泻、食欲减退，严重者食欲废绝等。阳性对照和用药组均在感染18h后开始死亡，治疗后的第5天临床病症明显减轻，而阳性对照组从攻毒开始至第8天，临床症状严重者陆续死亡，到第9天存小鼠临床病症基本消失。 2.3.2疗效 试验结束后增重情况可以看出，阳性对照试验结束时增重最少为27.9% ，阳性对照组和给药组差异显著（P0.05）；给药组与健康组之间差异极显著（P0.01）。死亡率、有效率和治愈率，阳性对照组、实验组，从治疗开始到第10天结束时小鼠死亡率分别为50%和36%，健康组小鼠的死亡率为0。由此可见，小鼠的死亡率，阳性对照与给药组之间有效
26、率存在显著性差异（P0.05）。经过治愈阳性对照组和MTYS给药组、存在差异（P0.05）。表1 耐药性大肠杆菌攻毒量对鼠的影响Table 1 The effect of resistant E.coli conteracting toxic substances quanity on mice攻毒菌株组别只数攻毒量（mL）含活菌数（CFU）精神沉郁（只） 死亡数（只）死亡率（%）人源2952组100.43.2109010100组100.21.61091333组100.10.8109000注：各观察纵项指标之间“*”表示差异显著（P0.05）；“#”表示在不给药的情况下自己好转或自愈；a与b、
27、b与c、c与d之间表示差异显著（P0.05），a与c,b与d表示差异极显著（P0.01）；相同字母表示差异不显著（P0.05）；“-”表示没有计算。2.4各组小鼠免疫器官指数的测定结果；表显示经2751、2952攻毒后，鼠的脾指数、肝指数变化不明显，经MTYS和MSS治疗后，MSS组可以显著提高鼠的肝指数，其它不明显。表2 鼠免疫器官指数结果 Table 2 results of immune organs index on mice (g/kg)组别脾指数（g/g）肝指数（g/g）阴性对照组A组0.0040.0020.0290.317攻毒2952组B组0.0030.0000.025 0.12
28、4攻毒2952+MTYS组C组0.0050.0010.045 0.091注：*表示阴性对照组比差异显著P0.052.5 血清及组织细胞因子检测2.5.1 NO对小鼠免疫功能的影响 小鼠经人工感染耐药大肠杆菌后，血液中阳性对照组极显著低于治疗组和健康组，肝中阳性对照组和攻毒治疗组NO的水平显著高于健康组，脾中NO的水平阳性对照组极显著高于治疗组和健康组，说明感染耐药大肠杆菌后显著降低了血液中的NO水平，极显著增加肝、脾的水平。经过治疗后，血液、脾脏的水平逐渐恢复正常，而肝内水平持续走高。表3 小鼠人工感染大肠杆菌治疗前后的NO量的变化(ng/mg)A攻毒2952C2952+MTYSE血12.23
29、1.1624.210.72Ab11.394.47肝6.60.59.611.35a10.360.05A脾0.070.119.214.99AB0.210.15 A注：纵列 “A”表示与阴性对照比较差异极显著（P0.01）；“B”表示与阳性对照比较差异显著（P0.01）；小写为差异显著。2.5.2白介素2对鼠免疫功能的影响表4 小鼠人工感染大肠杆菌治疗前后的 IL-2量的变化(ng/mg)A阳性对照组攻毒治疗组血1.40.41.370.381.730.79肝2.260.022.580.031.280.40AB脾0.840.130.950.171.380.26A 注：纵列 “A”表示与阴性对照比较差异
30、极显著（P0.01）；“B”表示与阳性对照比较差异显著（P0.01）；小写为差异显著。小鼠经人工感染耐药大肠杆菌后，血液中IL-2的水平变化不明显，肝中阳性对照组高于健康组，治疗后极显著下降，脾中IL-2的水平极显著高于治疗组和健康组，说明感染耐药大肠杆菌后极显著增加肝、脾的水平。经过治疗后，肝内水平下降，脾内水平持续走高。2.5.3 白介素6对鼠免疫功能的影响表5 小鼠人工感染大肠杆菌治疗前后的血液中IL-6量的变化(ng/mg)健康组攻毒治疗组阳性对照组105.796.352.23.72 A500 A注：纵列 “A”表示与阴性对照比较差异极显著（P0.01）；3讨论3.1 讨论MTYS提取
31、物能够调节机体免疫力，增进食欲，使生化指标有一个很好的检测效果，这与许多报道中中药可提高机体的生长性能相似14。据报道，许多中草药对病菌和病毒具有抑制和杀灭的作用，而且能双向调节机体的免疫功能，促进免疫器官淋巴细胞和其它免疫细胞发生、分化、成熟、定居和增殖以及产生免疫应答，这与中药的化学成分有关15。3.1.1促进机体免疫器官的发育，提高机体免疫力中药能够发挥其效力，主要是通过中药的活性成分而实现的，中药的活性成分较复杂，包括生物碱、甙类、挥发油、糖类、油脂、有机酸等16。在MTYS中的黄芪和茯苓等中的多糖有益成分能够促进小鼠胸腺的发育，增加其重量，这与安松兰、王志祥17等的报道相一致，能够提
32、高胸腺指数；能够提高饲料转化率，促进生长。据报道，甘草中的甘草酸和茯苓中的茯苓多糖具有非特异性免疫调节作用，增强细胞免疫，增强巨噬细胞吞噬功能，选择性地增强辅助性T淋巴细胞的增殖能力和活性，使IgA和IgG明显降低，对肝功能具有明显的改善作用18。本试验中阳性对照组IgA、IgG和IgM明显增高，而经过处理后的试验组IgA、IgG和IgM得到恢复或接近正常。这充分说明MTYS能显著降低IgA、IgG和gM含量的作用，从而提高机体非特异性细胞免疫功能，表现在肝功能的恢复。邱全瑛等观察黄柏水煎剂及其主要生物碱-小檗碱对小鼠免疫功能的影响，结果表明黄柏可明显抑制小鼠对IgM的生成，降低腹腔M吞噬中性
33、粒的作用，说明黄柏有较强的免疫抑制作用。总之，本试验结果显示使用MTYS能够明显提高胸腺指数，使免疫球蛋白IgG、IgA、IgM在阳性对照组中均显著升高，经治疗后基本恢复正常，表明MTYS在调节机体免疫功能，增强机体自身免疫能力方面有着重要的意义。由上所述与本试验的结果相吻合，说明MTYS能够保护肝细胞膜的结构，促进肝糖原合成，调节血糖浓度，改善肝功能，对肝脏具有保护作用。4结论4.1加减三黄汤对多重耐药性大肠杆菌的抑菌效果较好。4.2中药MSS的使用剂量，以每天每只鼠0.5mL为宜，耐药性大肠杆菌2952菌株每只鼠的接种量以原液的0.2ml（1.6109CFU）为宜。4.3加减三黄汤可以提高
34、小鼠体内血清及组织细胞因子IL-2含量，从而增加免疫力。4.4加减三黄汤使小鼠体内血清中IL-6的含量增加，提高机体免疫应答、防御能力。4.5加减三黄汤通过对NO的变化，调节脾的免疫保护作用较强，对肝次之。参考文献1 朱立军，动物大肠杆菌耐药性的变化趋势 J. 中国兽医杂志，2001，35（2）：16-18 2 AugustusA M, Celaya T, Husain F, et al. Antibiotic-sensitive TolC mutants and their suppressors. J Bacteriol.2004, 186(6): 185160.3 Dantzig A H
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