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1、附件2A表：内蒙古自治区高等学校科学技术研究项目申 请 书项目类别（在相应选项上划）1、自然科学研究（ ）重点项目（ ）一般项目 （ ）自筹经费项目 2、人文社会科学研究（ ）重点项目（ ）一般项目 （ ）自筹经费项目学 科 门 类： 二级学科 课 题 名 称：甘露糖结合凝集素基因多态性及血清 表达与COPD患者急性加重的相关性研究项目负责人： 孙丽蓉 所 在 学 校：包头医学院第二附属医院申 请 日 期： 2014年8月14日 内蒙古自治区教育厅科学技术处制2014年6月填表说明1学科门类按照国家质量技术监督局1992年公布的学科分类与代码，填写一级和二级学科。2申请书一律用A4纸双面打印，
2、于左侧装订，A表一式1份，B表一式5份。3本表各栏除特别规定外，均可以自行加行、加页。4为填报内容提供的证明材料，统一装订在申请书最后部分。项目负责人承诺我确认本申请书及附件内容真实、准确。如果获得资助，我将认真履行项目负责人职责，积极组织开展研究工作，合理安排研究经费，按时报送有关材料并接受检查。若申请书及附件内容失实或在项目执行过程中违反科研项目管理的有关规定，本人将承担全部责任。 负责人签字：孙丽蓉 20 1 4 年 08 月 14 日项目依托学校承诺已经按照项目申报要求对项目申请人的资格及项目申请书内容进行了审核。项目如获资助，我单位将根据教育厅要求和项目申请书内容，落实项目研究所需配
3、套经费及其他条件；按照科研项目管理有关规定，认真履行项目承担单位的管理职责。学校公章 20 年 月 日 申请者姓名孙丽蓉性别女出生年月1962.10.19职称教授所在院系包头医学院第二附属医院呼吸科职务科主任最后学历硕士研究生最后学位硕士外语语种英语外语水平国家六级专业领域 COPD通讯地址包头医学院第二附属医院呼吸科邮政编码014030办公电话0472-3169660移动电话18648649906项目组其他成员情况（不包括项目负责人，最多不能超过9人）姓名职称年龄所在单位专业项目分工签名苏日娜住院医师28岁包医第二附属医院呼吸内科项目实施张毅主治医师34岁包医第二附属医院呼吸内科统计数据马显
4、军主治医师31岁包医第二附属医院呼吸内科收集资料高扬副主任医师41岁包医第二附属医院呼吸内科收集资料李水霞主治医师35岁包医第二附属医院呼吸内科收集资料 孔祥成住院医师28岁包医第二附属医院 呼吸内科整理资料 李冬梅副主任医师45岁包医第二附属医院 呼吸内科整理资料 申请者承担省级以上项目及完成情况项目批准单位项目名称批准时间是否完成内蒙古科研项目Il-1、IL-6基因多态性与COPD肺动脉高压相关性研究2011是 申请者本人进三年来的主要研究成果：1、 eNOS基因多态性与COPD肺动脉高压相关性研究 中华结核和呼吸病杂志2、人防御素1基因多态性与慢性阻塞性肺疾病关系的研究 医学研究杂志3、
5、IL-1,IL-6的基因多态性与COPD肺动脉高压的相关性研究 医学研究杂志4、COPD系统性炎症与原发性高血压的相关研究 5、COPD大动脉弹性与血管内皮功能的关系临床肺科杂志6、COPD系统性炎症与大动脉弹性的相关性研究国际呼吸病杂志 2013年01月2013年12月 是项目计划进度第一阶段：查找资料，拟定题目（2014.1-2014.03）第二阶段：采集标本，订购试剂及预实验（2014.4-2014.06）第三阶段: 预实验（2014.07-2014.09）第四阶段：实验阶段（2014.10-2015.09）第五阶段：数据整理，实验结果分析（2015.10-2015.12 ）项目成果形式
6、 慢性阻塞性肺疾病的发病率及死亡率逐年上升，是一种具有气流受限特征的疾病，气流受限不完全可逆，呈进行性进展，与对有害气体和有害颗粒的异常炎症反应有关。急性加重在COPD患者的发病和死亡中起着关键作用，频繁的感染引起COPD反复急性发作，导致肺功能下降加速、合并症的发生、住院，。以致致残，导致生活质量的降低因此，这种疾病带来了巨大的经济及社会负担。甘露糖结合外源凝集素（MBL）是凝集素途径活化补体中的一种关键分子。其主要作用是在血浆作为一种模式识别受体，通过结合暴露在侵入细菌表面的甘露糖引发先天性免疫防御反应。从而起到抵抗外界微生物感染的作用。COPD其基因多态性会引起MBL生成下降。从而引起C
7、OPD急性加重。 MBL缺乏的COPD患者感染加重的频率以及临床预后的作用目前尚未完全明了，因此本研究旨在分析MBL基因多态性与COPA急性加重的关系，为COPD防治提供依据，进而起到减轻其经济及社会负担。B表： 内蒙古自治区高等学校科学研究项目匿 名 评 审 书项目名称甘露糖结合凝集素基因多态性及血清表达与COPD患者急性加重的相关性研究起止时间2014.1-2015.12研究方向慢性阻塞性肺疾病一、本项目国内外研究现状及趋势，研究本课题的实际意义和理论意义（限1000字） 慢性阻塞性肺疾病（COPD）的发病率及死亡率逐年上升，根据2002年的统计数据，COPD位列世界上第四大主要死亡原因之
8、一。感染在COPD患者的发病和死亡中起着关键作用，频繁的感染引起COPD反复急性发作，导致肺功能下降加速、增加住院以及死亡率。因此，这种疾病带来了巨大的经济和社会负担。因此需要了解COPD患者的感染易感性，为COPD防治提供依据，提高患者生活质量，减轻其经济及社会负担。 慢性阻塞性肺疾病，是一种具有气流受限特征的疾病，气流受限不完全可逆，呈进行性进展，与对有害气体和有害颗粒的异常炎症反应有关。COPD的发生及发展是环境、遗传等多种因素共同参与的结果。比较确切的原因有感染、吸烟、职业性粉尘和有害气体的长期吸入、过敏等。目前文献阐述最为详尽的COPD遗传因素是遗传性a1-抗议蛋白酶缺乏症。频繁的感
9、染，引起COPD反复急性发作，增加患者的住院及死亡率。本项研究将讨论MBL基因多态性，甘露糖结合外源凝集素（MBL）是凝集素途径活化补体中的一种关键分子。其主要作用是在血浆作为一种模式识别受体，通过结合暴露在侵入细菌表面的甘露糖激活补体系统。研究发现MBL2基因外显子1区的第54位密码子的多态性，由甘氨酸被天冬氨酸所替代所致，其基因多态性导致血清MBL水平下降。国外Dahl M等研究发现缺乏MBL将增加COPD、哮喘等疾病的易感性。研究发现MBL在黏液防御屏障中起着很重要的作用，并且出现在肺炎患者的支气管肺泡灌洗液中。很多研究发现由MBL2基因第54位密码子的多态性引起的MBL缺乏与COPD患
10、者住院有着非常强的关联，这种缺乏同样也与反复呼吸道感染有关。Yang IA等研究发现MBL缺乏会增加感染风险。MBL2基因编码区及启动子区的核苷酸多态性会影响血浆MBL水平。MBL下降与儿童呼吸道感染频率、肺部感染、成人中系统性红斑狼疮和侵入肺炎链球菌等疾病的发生有关。在囊性纤维化中MBL2下降会增加肺功能受损程度及死亡。MBL缺乏在COPD患者感染加重的频率以及临床预后中的作用目前尚未完全明了，因此本前瞻性研究旨在评估它们关系，从而将研究结果服务于对COPD的诊治上面。关于此项研究目前国内尚无相关性报道。二、 项目研究的内容，预计突破哪些难题（限1000字） 1、研究内容1）、研究对象：病例
11、组：选自包医二附院呼吸科住院COPD患者，年龄与性别不限，COPD诊断符合2013年中华医学会呼吸病学会修定的COPD诊断标准（使用支气管舒张剂后FEV1/FVC70%）。同时排除原发性高血压、冠心病、糖尿病、肿瘤、肝肾功能异常。并根据慢性阻塞性肺疾病患者的症状、肺功能分级、急性加重的风险来综合评估。急性加重期需符合呼吸困难、咳嗽、咳痰、气短喘息等症状短期内明显加重超过日常变异范围，需要调整COPD患者的治疗方案。对照组：我院健康的体检者，无COPD病史，无心、肝、肾疾病史，体检、常规化验无异常。2） 研究方法： 根据急性加重次数分组：将本项研究中纳入的COPD患者分入2个组：一个组为（反复加
12、重者），入选2年内感染加重发作的平均次数2次。 另外一个组为入选2年内感染加重的平均次数2次的患者。 MBL基因多态性的检测：每位受试对象均被抽取空腹静脉血2ml，放入血常规中，EDAT抗凝，-20冰柜可长时间保存。用盐析法提取白细胞中的基因组DNA,以SDS裂解白细胞,蛋白酶K消化蛋白和乙醇沉淀获得基因组DNA。利用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP）技术分析MBL2基因外显子1区的第54位密码子的多态性。MBL基因第54号密码子存在GGC/GAC的变异,表现为野生纯合子A/A(GGC/GGC)、杂合子A/B(GGC/GAC)、变异型纯合子B/B(GAC/GAC)。PCR反
13、应引物参考文献设计。PCR反应体系：10扩增缓冲液5ul；0.2mMdATP、dCTP、dGTP、dTTP 5ul；上游引物（5GTAGGACAGAGGCATGCTC-3）、下游引物（3-CAGGCAGTTTCCTCTGGAAGG-5）0.25uM各2.0ul；耐热DNA聚合酶1.0U；DNA模板1.0ul。扩增条件为94预变性3min，其后94预变性3min、55退火1min、72延伸1min，共35个循环，最后72延伸7min。酶切反应体系：10内切酶缓冲液2.0ul，PCR扩增产物8ul，加BanI酶1.0ul，灭菌去离子水9.0ul总体积20.0ul混匀，37水浴6小时。酶切产物用2%
14、琼脂糖凝胶电泳，在紫外投射仪中观察记录并拍照，分析并判断基因型。 MBL浓度的测定：所有处于稳定的COPD病人及对照健康人均经禁食及无吸氧10h后，于6:008: 00AM肘前静脉采集外周血标本。血液经4000r/min离心除去血细胞，所有血清标本保存于-70C待测。采用MBL的ELISA试剂盒采用固相酶联免疫法检测血清MBL的质量浓度，在450nm紫外线灯下读吸光值。2、预计突破难题：1）MBL-2基因多态性的检测2）MBL浓度的测定3）MBL-2基因多态性与血清MBL浓度的关系4）MBL缺乏组的定义 5）严格执行同一规范的诊断标准和入选排除标准，严格按实验流程操作。三、 现有研究基础，课题
15、组开展此项研究具备的条件（限500字）1. 申请者本人主持了 ，等科研工作，并在国家级、省级刊物发表论文十余篇，积累了丰富的临床、科研经验。 2.课题组人员结合专业知识、通过反复查阅国内外文献资料，对本研究的国内外研究现状及趋势，研究本课题的实际意义和理论意义有了较全面的认识。 3.具备专业的分子生物实验室。 4.已具备的实验条件及资料：肺功能仪、微量移液器、PCR扩增仪、照相机、低温冰箱、电热恒温水槽、酶标仪、研究对象充足。四、研究思路、工作方案、技术路线（限600字）1、根据急性加重次数分组：将本项研究中纳入的COPD患者分入2个组：一个组为（反复加重者），入选2年内感染加重发作的平均次数
16、2次。 另外一个组为入选2年内感染加重的平均次数2次的患者。 2、MBL基因多态性的检测：每位受试对象均被抽取空腹静脉血2ml，放入血常规中，EDAT抗凝，-20冰柜可长时间保存。用盐析法提取白细胞中的基因组DNA,以SDS裂解白细胞,蛋白酶K消化蛋白和乙醇沉淀获得基因组DNA。利用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP）技术分析MBL2基因外显子1区的第54位密码子的多态性。MBL基因第54号密码子存在GGC/GAC的变异,表现为野生纯合子A/A(GGC/GGC)、杂合子A/B(GGC/GAC)、变异型纯合子B/B(GAC/GAC)。PCR反应引物参考文献设计。PCR反应体系：
17、10扩增缓冲液5ul；0.2mMdATP、dCTP、dGTP、dTTP 5ul；上游引物（5GTAGGACAGAGGCATGCTC-3）、下游引物（3-CAGGCAGTTTCCTCTGGAAGG-5）0.25uM各2.0ul；耐热DNA聚合酶1.0U；DNA模板1.0ul。扩增条件为94预变性3min，其后94预变性3min、55退火1min、72延伸1min，共35个循环，最后72延伸7min。酶切反应体系：10内切酶缓冲液2.0ul，PCR扩增产物8ul，加BanI酶1.0ul，灭菌去离子水9.0ul总体积20.0ul混匀，37水浴6小时。酶切产物用2%琼脂糖凝胶电泳，在紫外投射仪中观察记
18、录并拍照，分析并判断基因型。 3、MBL浓度的测定：所有处于稳定的COPD病人及对照健康人均经禁食及无吸氧10h后，于6:008: 00AM肘前静脉采集外周血标本。血液经4000r/min离心除去血细胞，所有血清标本保存于-70C待测。采用MBL的ELISA试剂盒采用固相酶联免疫法检测血清MBL的质量浓度，在450nm紫外线灯下读吸光值。五、项目经费预算（单位：万元） 项目经费总额5万申请资助数额配套资金数额开支明细经费备注设备购置费0分析测试费0.000 实验材料费3.000 购买试剂及使用材料、肺功能测定差旅费/调研费0.2500学术交流费0.5000出版费0.2500劳务费0.4000评审验收费0.5000 组织鉴定管理费其他费用0.1000合计5.0000自筹经费六、项目研究预计达到的目标1、MBL基因多态性导致MBL表达水平的改变，影响 COPD患者急性加重。2、MBL基因多态性导致MBL表达水平的改变，但不影响 COPD患者急性加重次数。3、MBL基因多态性不影响MBL表达水平，但影响COPD患者急性加重次数。4、MBL基因多态性不影响MBL表达水平及COPD患者急性加重次数。
