脂肪源干细胞移植治疗骨质疏松及其成骨分化蛋白质谱构建（可编辑） .doc

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1、脂肪源干细胞移植治疗骨质疏松及其成骨分化蛋白质谱构建 南方医科大学级博士学位论文脂肪源干细胞移植治疗骨质疏松及其成骨分化蛋白质谱构建?课题来源:国家重点基础研究规划项目编号:国家自然科学基金青年面上项目编号:广东省工业攻关项目编号:专 业 名 称人体解剖与组织胚胎学学位申请人 闻重秋指导 教 师 原 林教授答辩委员会主席 汪华侨教授苏光燮教授答辩委员会成员 朴英杰教授徐杰教授何宏文教授郭国庆教授黄泳教授论文评阅人 贺振泉教授安靓教授初国良副教授日年月 广州博士学位论文脂肪源干细胞治疗骨质疏松及其成骨分化差异蛋白质筛选博士研究生:闻重秋指导老师:原林教授摘 要背景骨质疏松是一种以骨量减少和骨微结

2、构破坏为特征,导致骨脆性增加和易于骨折的代谢性疾病。随着人口老龄化,骨质疏松患者不断增多,研究如何有效预防和治疗骨质疏松具有非常重要的临床价值。原林教授提出的“筋膜学假说认为人体是由尚未分化的非特异性结缔组织筋膜支架构成的支持与储备系统和被该支架支持与包绕的已分化为各种功能细胞构成的功能系统共同组成。功能系统是在各种功能细胞的专能特化的基础上,而支持与储备系统是以筋膜支架中未分化的干细胞为核心。支持与储备系统中未分化干细胞通过分化为各种定向干细胞,能够为功能系统中各种功能细胞的更新提供源源不断的细胞源泉,并为功能系统中各种功能细胞的代谢提供营养物质,维持内环境的稳定。因此,功能系统只有在支持与

3、储备系统的支持下,才能维持结构和功能的稳定,而一旦某种功能细胞在代谢过程中不能及时得到新的补充,机体就会出现相应的病变。骨质疏松正是由于骨组织吸收后,筋膜支架中未分化的干细胞未能充分向成骨细胞分化骨形成不足而致的一种疾病。因此,当骨代谢过程中出现负平衡后,如何有效增加筋膜支架中未分化的干细胞,使成骨细胞得到有效的补充,促进骨形成重建正平衡是治疗骨质疏松的关键。脂肪组织是支持与储备系统中重要储备,其中分离出的脂肪源干细胞摘要,是筋膜支架中未分化干细胞的一种重要细.胞储备形式。脂肪源干细胞的研究已成为干细胞研究的热点之一。研究表明:脂肪源干细胞易分离培养;具有多种分化潜能,甚至能够跨胚层分化,在特

4、定的环境中可以诱导向成骨、成肝细胞、成心肌细胞、成软骨、成脂、成肌和成神经等分化;具有低免疫原性和免疫调节功能。此外,与目前研究较多的骨髓干细胞相比,脂肪源干细胞来源更广,获得更加容易,并且给病人带来的创伤和痛苦更小。这些特征均为脂肪源干细胞的异体移植提供了有利条件。因此,通过增加机体未分化的脂肪源干细胞,促进其向成骨分化,增加骨形成可能会对骨质疏松起到预防和治疗作用。应用糖皮质激素建立骨质疏松模型已成为比较成熟的模型。长期给予大剂量的糖皮质激素可以通过引起体内钙磷代谢的紊乱,骨保护素分泌减少,甲状旁腺素的分泌增加,成骨细胞增殖和活性受到抑制而破骨细胞数量和活性增加等多种途径使骨吸收增加,骨形

5、成减少,最终导致骨质疏松。蛋白质组指“一个细胞或一个组织所表达的全部蛋白质,是对应于一个基因组的所有蛋白质构成的整体,而不仅局限于一个或几个蛋白质。蛋白质组学可以从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态,了解蛋白质之间的相互作用与联系,揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。由于蛋白质的分子量和所带净电荷是两个彼此不相关的重要性质,而双向电泳技术则同时利用这两个性质的差异来分离细胞中的总蛋白质,因此它的分离能力强大,可以快速准确的发现表达发生变化的蛋白质。为探讨异体脂肪源干细胞移植对骨质疏松的预防和治疗作用,及脂肪源干细胞成骨诱导中的蛋白质谱变化,本实验通过观察移植异体脂肪

6、源干细胞对糖皮质激素致骨质疏松大鼠骨组织形态计量学方面的影响及蛋白质谱变化分析进行综合评价,探索一种新的骨质疏松治疗方法,为临床骨质疏松的预防和治疗提供新的研究思路。目的、分离培养脂肪源干细胞并对其多向分化能力和表面标志进行鉴定,以判博士学位论文断支持与储备系统中是否含有未分化的脂肪源干细胞;、通过骨密度检测判断长期给予糖皮质激素建立骨质疏松模型是否成功:、通过骨组织形态计量学观察观察异体脂肪源干细胞对糖皮质激素致骨质.疏松大鼠骨组织微环境的影响;、对成骨周及周的脂肪源干细胞进行蛋白质谱分析。、为“筋膜学假说中“通过动员支持与储备系统中未分化干细胞可以治疗退行性和衰老性疾病提供部分实验依据。方

7、法、取成年大鼠腹股沟皮下脂肪垫,胶原酶消化分离培养筋膜结缔组织中脂肪源干细胞。传至第代时,分别通过形态学、成脂与成骨诱导分化及利用流式细胞术对表面抗原、和进行鉴定,判断所培养的细胞是否为具有多向分化潜能的脂肪源干细胞。、只雌性大鼠随机分成空白对照组组、模型组组、治疗组和治疗对照组组。、和组分别给予颈背部皮下注射醋酸泼尼松龙注射液/,次/周;组分别给予颈背部皮下注射生理盐水.,次/周。周后,将组和组处死取材,判断造模是否成功。、待模型建立成功后,收集传至第代的脂肪源干细胞,经尾静脉向组大鼠每只注射脂肪源干细胞个,组大鼠每只注射生理盐水,周后处死取材。、处死后取出右侧胫骨上/部分,矢状面剖开,固定

8、后酒精逐级脱水,分别浸入浸液甲基丙烯酸甲酯邻苯二甲酸二丁酯、浸液浸液过氧化苯甲酰和浸液浸液过氧化苯甲酰.各,再用新重型切骨机连续切取厚度切片,进行组鲜配制的浸液进行包埋。染色。测量区域为生长板织学观察染色和类骨质观察下至范围内,采用多功能彩色病理图像分析软件进行骨组织形态计量学分析。具体参数包括骨小梁相对体积厂、骨小梁厚度.、骨小梁数量.和骨小梁分离度.和单位骨小梁破骨细摘要胞数.,均采用国际通用的公式进行计算。、对诱导周、周及未诱导分化的脂肪源干细胞蛋白样本进行双向凝胶电泳分离,通过银染显色,获取三组细胞的蛋白组学图谱,通过比较三组细胞的图谱,挖取差异表达的蛋白点,进行基质辅助激光解析电离飞

9、行时间质谱肽质量指纹图分析和蛋白数据库信息检索。结果、经光学显微镜观察,原代培养的 后大部分可贴壁,细胞呈圆形、多边形或者梭形。细胞长势良好,后可按:传代,之后每可传代一次。经换液传代至第代,可见细胞形态均一,呈纺锤形或者多角形。体外诱导可以向成脂、成骨分化。流式细胞术检测发现和呈强阳性,呈弱阳性,、和呈阴性。、长期大剂量给予糖皮质激素后,与空白对照组比较,模型组大鼠骨小梁变细、变薄,骨小梁排列紊乱,骨小梁间出现断裂,间距增大,出现陷窝;骨小梁的数量、相对体积和厚度均显著降低,而骨小梁的分离度增高,单位骨小梁破骨细胞数增多氏.。、异体移植脂肪源干细胞后,与模型组比较,治疗组大鼠骨小梁数目增多,

10、骨小梁变厚变粗,骨小梁间出现连接,陷窝减少;骨小梁的数量、相当体积和厚度显著增加,而骨小梁分离度显著降低,单位骨小梁破骨细胞数减少尸.。、相对于未分化组,成骨周和成骨周变化趋势大于倍并且变化趋势一致的共个点。其中成骨组上调个蛋白,下调个蛋白。结论、支持与储备系统中含有脂肪源干细胞,并且这种干细胞是一种未分化的间充质干细胞:、长期给予大剂量的糖皮质激素可以建立骨质疏松模型;、诱导脂肪源干细胞向成骨分化,可以筛选出差异蛋白:、对“筋膜学假说中“通过动员筋膜结缔组织中储备的未分化干细胞可以治疗退行性疾病提供了部分实验依据。博士学位论文综上所述,移植异体脂肪源干细胞对糖皮质激素致骨质疏松大鼠有一定的治

11、疗作用,能够促进骨形成,增加骨密度,改善骨生物力学性能,降低骨折发生率。本实验进一步提示在骨质疏松的研究中应该更加关注提高机体干细胞的数量和促进干细胞向成骨细胞分化及骨组织的形成方面,为临床上治疗骨质疏松提供了一种新的研究思路。关键词筋膜学脂肪源干细胞骨质疏松糖皮质激素骨密度差异蛋白质蛋白组学博士学位论文: .一一: .,. ? , ? . 、., ., . ., . ,. ,. ,., . ., . .? , . , . , . .、衍 . ,.博士学位论文., , . ., . . . , . , .,弱,.,. 、,/. .伍 ,. . / ,. , 舶 . . 、析?. . 厂 .,.

12、,.,., ,.、 ? , . ,?., . .,:, ., .,、, . 、析. , 博士学位论文. .、, , . ? .,. . . , ? ,. . ;:;博士学位论文目 录摘要?.前 言?.第一章脂肪源干细胞的分离培养及鉴定?.材料和方法结果?.讨论参考文献附图?.第二章 异体脂肪源干细胞移植对大鼠骨质疏松骨组织微结构的影响.材料与方法?.结果讨论参考文献附图第三章脂肪组织来源干细胞成骨诱导分化差异蛋白质的筛选?.材料与方法?.结果讨论参考文献附图全文小结。综述.目 录博士研究生期间发表的论文?.致谢.学位论文原创性声明.统计学审稿证明博士学位论文前 言骨质疏松是一种以骨量减少和骨微

13、结构破坏为特征,导致骨脆性增加和易于骨折的代谢性疾病。随着人口老龄化,骨质疏松患者不断增多,研究如何有效预防和治疗骨质疏松具有非常重要的临床价值。原林教授提出的“筋膜学假说认为人体是由尚未分化的非特异性结缔组织筋膜支架构成的支持与储备系统和被该支架支持与包绕的已分化为各种功能细胞构成的功能系统共同组成。功能系统是在各种功能细胞的专能特化的基础上,而支持与储备系统是以筋膜支架中未分化的干细胞为核心。支持与储备系统中未分化干细胞通过分化为各种定向干细胞,能够为功能系统中各种功能细胞的更新提供源源不断的细胞源泉,并为功能系统中各种功能细胞的代谢提供营养物质,维持内环境的稳定。因此,功能系统只有在支持

14、与储备系统的支持下,才能维持结构和功能的稳定,而一旦某种功能细胞在代谢过程中不能及时得到新的补充,机体就会出现相应的病变。骨质疏松正是由于骨组织吸收后,筋膜支架中未分化的干细胞未能充分向成骨细胞分化骨形成不足而致的一种疾病。因此,当骨代谢过程中出现负平衡后,如何有效增加筋膜支架中未分化的干细胞,使成骨细胞得到有效的补充,促进骨形成重建正平衡是治疗骨质疏松的关键。 .脂肪组织是支持与储备系统中重要储备,其中分离出的脂肪源干细胞,是筋膜支架中未分化干细胞的一种重要细.胞储备形式。脂肪源干细胞的研究已成为干细胞研究的热点之一。研究表明:脂肪源干细胞易分离培养;具有多种分化潜能,甚至能够跨胚层分化,在

15、特定的环境中可以诱导向成骨、成肝细胞、成心肌细胞、成软骨、成脂、成肌和成神经等分化;具有低免疫原性和免疫调节功能。此外,与目前研究较多的骨髓干细胞相比,脂肪源干细胞来源更广,获得更加容易,并且给病人带来的创伤和痛苦更小。这些特征均为脂肪源干细胞的异体移植提供了有利条件。因此,通过增加机体未分化的脂肪源干细胞,促进其向成骨分化,增加骨形成可能会对骨质疏松起到预防和治疗作用。前言应用糖皮质激素建立骨质疏松模型已成为比较成熟的模型。长期给予大剂量的糖皮质激素可以通过引起体内钙磷代谢的紊乱,骨保护素分泌减少,甲状旁腺素的分泌增加,成骨细胞增殖和活性受到抑制而破骨细胞数量和活性增加等多种途径使骨吸收增加

16、,骨形成减少,最终导致骨质疏松。蛋白质组指“一个细胞或一个组织所表达的全部蛋白质,是对应于一个基因组的所有蛋白质构成的整体,而不仅局限于一个或几个蛋白质。蛋白质组学可以从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态,了解蛋白质之间的相互作用与联系,揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。由于蛋白质的分子量和所带净电荷是两个彼此不相关的重要性质,而双向电泳技术则同时利用这两个性质的差异来分离细胞中的总蛋白质,因此它的分离能力强大,可以快速准确的发现表达发生变化的蛋白质。为探讨异体脂肪源干细胞移植对骨质疏松的预防和治疗作用,及脂肪源干细胞成骨诱导中的蛋白质谱变化,本实验通过观察移植异

17、体脂肪源干细胞对糖皮质激素致骨质疏松大鼠骨组织形态计量学方面的影响及蛋白质谱变化分析进行综合评价,探索一种新的骨质疏松治疗方法,为临床骨质疏松的预防和治疗提供新的研究思路。博士学位论文第一章脂肪源干细胞的分离培养及鉴定,是目前再生医学研究的热点之间充质干细胞一,是成体干细胞的一种,具有自我更新和多向分化的潜能,在再生医学中有重要的应用价值【。目前发现可以从骨髓、脐带血、外周血及脂肪等多种组织中分离出间充质干细胞【一钉。在众多间充质干细胞当中研究较为深入的是骨髓间充质干细胞,在特定的条件下可以向成骨细胞、软骨细胞、脂肪组织及神经元、神经胶质细胞等分化,是一种目前使用较为广泛的种子细胞,并取得了一

18、定临,的床效果】。近年来,随着对脂肪源干细胞.研究不断深入,发现易分离培养【,可以多向分化甚至跨胚层分化【,具有低免疫原性、免疫调节和免疫抑制等特点【】,这些均为的异体移植及应用于再生医学提供了有利条件。此外,与骨髓间充质干细胞相比,来源更加广泛、取材更加容易、给病人带来的创伤和痛苦更.。因此,作为种子细胞治疗疾病具有更广阔的前景【】。原林教授提出的“筋膜学理论【.】将人体分为两个系统,即由遍布全身的非特异性结缔组织支架构成的支持与储备系统和被该筋膜支架支持与包绕的各种功能细胞构成的功能系统共同组成。间充质干细胞的多组织来源,与筋膜支架的全身分布是一致的。其横向和纵向分化的特性亦与筋膜学中筋膜

19、支架能够为功能系统提供支持与储备作用相符合。其中是筋膜支架中储备的未分化干细胞的主要细胞成分】。本实验,取大鼠腹股沟皮下脂肪垫进行分离培养得到,通过其形态学、成脂肪与成骨分化能力及细胞表型,从多方面对其进行鉴定。材料和方法.实验动物只周龄健康大鼠,雌性,由南方医科大学实验动物中心提供,许可证号:粤.。第一章脂肪源干细胞的分离培养及鉴定公司,美国公司,美国青霉素公司,美国链霉素公司,美国胎牛血清公司,美国型胶原酶公司,美国公司,美国胰蛋白酶公司,美国粉公司,美国公司,美国.液威佳公司,中国液威佳公司,中国地塞米松公司,美国异丁基甲基黄嘌呤公司,美国吲哚美辛公司,美国胰岛素公司,美国油红公司,美国

20、口一甘油磷酸钠公司,美国.抗坏血酸维生素公司,美国茜素红威佳公司,中国小鼠单克隆抗大鼠公司,美国小鼠单克隆抗大鼠公司,美国小鼠单克隆抗大鼠公司,美国小鼠单克隆抗大鼠公司,美国博士学位论文小鼠单克隆抗大鼠公司,美国小鼠单克隆抗大鼠公司,美国培养瓶公司,美国.超净工作台公司,日本二氧化碳培养箱 公司,德国.低温离心机公司,美国电热恒温水浴槽 森信.,中国微量移液器公司,德国.倒置相差显微镜公司,日本流式细胞仪公司,美国数码相机公司,日本.主要用液的配制%水合氯醛麻醉剂水合氯醛去离子水基础培养基的配制.青霉素 万链霉素 万四蒸水将配制所需成分加入四蒸水后,磁力棒搅拌充分溶解后,用微孔滤膜正压抽滤器内

21、置张.滤膜抽滤后,用无菌盐水瓶分装,每瓶装,密封冷藏保存。试纸检测培养基值,调整培养基值至.。在使用前,每瓶液中加入胎牛血清配制成含有%的完全培养基。液的配制第一章脂肪源干细胞的分离培养及鉴定.出 .四蒸水将配制所需成分加入四蒸水充分溶解后,用.%调整值至.,高压蒸汽灭菌,每瓶分装保存。.%型胶原酶配制胶原酶.正压抽滤,每瓶分装保存。成脂培养基的配制完全培养基地塞米松.甲基.异丙基.黄嘌呤.维生素 成骨培养基的配制完全培养基地塞米松.甘油磷酸钠维生素 .%胰酶消化液的配制胰蛋白酶 .液正压抽滤,。保存。油红存储液的配制油红干粉.异丙醇博士学位论文充分溶解后,棕色瓶保存。在使用前稀释油红储存液油

22、红:去离子水:,滤纸过滤,室温放置后使用稀释后以内使用。.%茜素红溶液茜素红蒸馏水充分溶解后,用%氢氧化胺调整值至.,棕色瓶避光保存。.实验动物:大鼠,雌雄不限,南方医科大学实验动物中心购买,许 可证号粤.实验方法. 的分离培养【】周龄雌性大鼠,%水合氯醛/体质量腹腔内注射致全身麻醉后,无菌条件下剪取腹股沟部皮下脂肪垫,去除肉眼可见的小血管。液冲洗次以去除红细胞,眼科剪剪碎至大小。加入倍体积的.%型胶原酶,吹打搅拌混匀,下间断震荡消化。用等体积的含%胎牛血清的高糖中和,/离心,去除上清,再用含%胎牛血清的高糖重悬细胞,目筛网过滤,四格计数板计数后以/的密度接种于培养瓶中,放置于、%培养箱中培养

23、。后首次换液,之后每.换液次,待长满融合至瓶底%时用.%胰蛋白酶/.%消化后以:进行传代,倒置相差显微镜下观察照相。.的成脂诱导分化及鉴定【待第代培养至%以上融合时,常规消化收集细胞,以/的密度接种于孔板中,常规加入完全培养基。后,待细胞贴壁良好,进行换液。其中孔加入成脂诱导液,其余孔加入完全培养基作为对照。之后每.换液一次。周后吸尽培养基,漂洗,次。然后用%多聚甲醛室温固定,弃固定液,冲洗次,%异丙醇冲洗。最后在每个孔各加入第一章脂肪源干细胞的分离培养及鉴定稀释的油红工作液,加盖。室温放置后,弃染液。%异丙醇分色至背景无色后,. 充分冲洗,倒置显微镜下观察脂质沉积并拍照。.的成骨诱导分化及鉴

24、定【,待第代培养至%以上融合时,常规消化收集细胞,以/的密度接种于孔板中,常规加入完全培养基。后,待细胞贴壁良好,进行换液。其中孔加入成骨诱导液,其余孔加入完全培养基作为对照。之后每?换液一次。活性检测:成骨诱导组和对照组在第用重氮盐法改良的氏法检测活性。操作程序如下:多聚甲醛固定,水洗、晾干,滴加新鲜配制的底物液体盖满样本,放置湿盒内反应,水洗、晾干:光镜下观察,阳性者可见胞浆中出现红或红棕色颗粒,用倒置显微镜观察并拍照。钙结节染色茜素红染色:后用茜素红染色检测矿化结节。首先,弃培养基,加入液漂洗次,分钟/次。然后,用%多聚甲醛室温固定,弃固定液,冲洗次。每孔加入茜素红染液,室温下置摇床后,

25、弃液。最后,再向每孔中加入去离子水,轻摇洗,共次后,用倒置显微镜观察矿化结节并拍照。.的表面标志鉴定将传至第代的用.%胰蛋白酶/.%消化后,/重悬,细胞计数后按照没管个细胞分装离心,弃上清后.至离心管。再次以/离心,弃上清后加入微升重悬细胞。分别加入一抗:标记的小鼠单克隆抗大鼠、,标记的小鼠、。单克隆抗大鼠、,标记的小鼠单克隆抗大鼠重悬细胞,室温避光孵育后,加入含%的,/离心。弃上清后再次加入含%的重悬,离心,弃上清。加入微升含%的后,用流式细胞仪检测上述种表面标志的表达率。实验共重复次。博士学位论文结果.的形态经光学倒置显微镜观察,原代培养的后大部分可贴壁,细胞呈圆形、多边形、多角形或者梭形

26、。细胞长势良好,.后可按:传代,之后每.可传代一次。经换液传代至第代,可见细胞形态均一,呈纺锤形或者多角形图.。.的表面标志鉴定通过流式细胞仪对第代的表面标志物鉴定显示:和呈强阳性,阳性率达到%以上;也呈弱阳性,阳性率达到.%;而、和呈阴性,阴性率达到%以上图.。.的成骨诱导分化加入成骨诱导液后,的形态由纺锤形、多角形逐渐转化成鳞片形、方形或者三角形等。细胞外基质分泌增多,可见少量黑色细小颗粒。随着时间延长,细胞呈现铺路石样,重叠生长,并分泌大量细胞外基质,形成大小不一的结节状基质。染色可见成骨诱导后,成骨诱导组胞浆中出现红或红棕色颗粒图.。茜素红染色显示成骨诱导后,呈特异性的粉红色矿化结节。

27、而阴性对照组无被染成粉红色的矿化结节图.。.的成脂诱导分化加入诱导液后,逐渐由纺锤形、多角形变成圆形或者椭圆形。第天起胞质内可见散在的圆形或椭圆形小脂滴,随着时间延长,这些小脂滴逐渐增多并相互融合成较大脂滴。诱导后,通过油红染色显示脂滴呈特异性的亮红色。而阴性对照组无被染亮红的脂滴图.第一章脂肪源干细胞的分离培养及鉴定讨论近年来,原林教授提出的“筋膜学”理论【】认为:人体是由尚未分化的非特异性结缔组织筋膜支架构成的支持与储备系统和被该支架支持与包绕的由已分化为功能细胞专能细胞构成的功能系统共同组成。结缔组织中未分化干细胞是支持与储备系统中细胞储备的主要成分,通过动员筋膜支架中的未分化干细胞向各

28、种定向干细胞分化,可为功能系统中专能细胞的更新提供源源不断的细胞补充,并为专能细胞的代谢提供稳定的内环境。功能系统是建立在已分化的功能细胞的专能特化功能基础上的,只有在支持与储备系统的支持下才,能维持结构与功能的稳定。其中,脂肪源干细胞.是筋膜中的一种重要的干细胞成分【。自年等首次从脂肪组织中分离培养脂肪源干细胞成功以来,现已大量研究【埘表明:脂肪源干细胞是间充质干细胞的一种;与其它间充质干细胞一样均来源于中胚层;具有自我更新和多向分化潜能,甚至能够跨胚层分化,可诱导向成脂肪、成骨、成软骨、成骨骼肌和成神经元等分化;具有低免疫原性、免疫抑制和免疫调节等特点。这些条件均为脂肪源干细胞的同种异体移

29、植提供了可能。此外,与其它间充质干细胞尤其是骨髓间充质干细胞相比,脂肪源干细胞更具优势,如其来源更加广泛、更易分离培养、给患者带来的创伤和痛苦更小【卯。因此,异体脂肪源干细胞移植应该具有更广阔的临床应用前景。从脂肪组织中分离培养脂肪源干细胞的方法,文献报道并不完全相同,但其主要方法均是利用胶原酶进行酶消化,离心过滤后将所获得的间充质组织碎片种植于细胞培养瓶中,加入含有%左右的高糖进行贴壁培养,经过多次传代后自然剔除一些其它细胞如红细胞,从而获得脂肪源干细胞。目前,对于脂肪源干细胞的鉴定并无确切的方法,文献报道也多种多样。纵观各种方法,主要是从以下几个方面对其进行鉴定】:细胞形态:细胞经过多次传

30、代后仍然能够保持增殖能力,且随着传代次数的增多,细胞的形博士学位论文态逐渐单一,呈现长梭形或者多角形;多向分化能力:加入特定诱导剂后进行体外培养,可以向成脂肪、成骨、成软骨、成骨骼肌或者成神经元等诱导分化,从而证实其具有多向分化潜能;表型鉴定:目前仍未发现脂肪源干细胞特异性表面标志物,故主要采用的是排除法。首先,通过对间充质干细胞的表面标志物如、等检测,鉴定其是一种间充质干细胞;然后,再通过对、的检测排除其为造血干细胞等其它干细胞的可能。本实验中,通过采用等提出的分离培养方法能够稳定的从大鼠腹股沟皮下脂肪垫中获取细胞。细胞传至第代,细胞状态未见改变,仍具有良好的增殖能力,传代时间始终为.,并且

31、随着传代次数的增多,细胞的形态逐渐均一,呈现长梭形、多角形等类似成纤维细胞的形态,与文献报道【】相一致。将细胞传至第代后,分别加入特定的成脂肪和成骨诱导液。成脂肪诱导后,细胞逐渐由长梭形、多角形变成圆形或者椭圆形,并出现圆形或椭圆形小脂滴,随着时间延长,这些小脂滴逐渐增多并相互融合形成较大脂滴。诱导天后,利用油红染色可清晰显示脂肪细胞内有脂滴存在,呈亮红色;成骨诱导后,细胞逐渐由长梭形、多角形逐渐转化成鳞片形、方形或三角形等形态,细胞外基质分泌逐渐增多,可见少量黑色细小颗粒,随着时间延长,细胞重叠生长,呈铺路石样,并分泌大量细胞外基质,形成大小不一的结节状基质。诱导天后,通过茜素红染色可清晰显

32、示形成的矿化结节。这表明第代细胞具有多能干细胞的特性,能够向多个方向分化。通过流式细胞术对第代细胞表面标志物进行检测发现,和呈强阳性,而 和呈阴性,均于文献报道一致【。这表明所培养的细胞为一种间充质干细胞,并且排除了造血干细胞的可能。目前国内外文献报道对于和的表达结果相当矛盾,有阴性表达和强阳性表达的报道。导致这种差异的原因尚不明确,推测可能是与动物的种系及细胞代数有关。本实验中呈现阴性,这与等报道一致:内皮细胞标记物呈第一章脂肪源干细胞的分离培养及鉴定现弱阳性,这与等报道一致【。这些表明第代的细胞并没有达到完全纯化。综上所述,本实验中所分离、培养所获得的细胞即为脂肪源干细胞。这不仅进一步验证

33、了筋膜学理论中“筋膜组织支架内存在大量的未分化干细胞储备这一理论,也为将来利用脂肪源干细胞移植治疗疾病以验证“通过动员筋膜中未分化的干细胞储备可以治疗疾病”提供了可能。博士学位论文参考文献.】 , ,:.【】. .,: : 【】 , , . . ,:. ., ,】 . . ., :?., . 【】 , ,. ., :. 【】 , , .,:.】孙慧如,王英,董明敏.豚鼠脂肪干细胞的分离培养与鉴定【】.中国组织工程研究与临床康复.,:.,【】 , .【. .,:】韩长杰,杨向群,张传森.脂肪干细胞的免疫学性质忉.中国组织工程研究与临床康复.,:.【】 , .:. .,:., 【】 , 第一章脂肪

34、源干细胞的分离培养及鉴定: .,:.【】 , , ,. .】【】.【 】 , , , . ,:?.【】原林,钟世镇.人体自体检测与调控系统筋膜学一经络有关的解剖学基础】.天津中医药.,:.【】杨春,李东飞,戴景兴,等.异体脂肪源干细胞移植对大鼠的抗衰老作用阴.解剖学报.,:. :【 】 , , ,.? . . ,:【】 , , ,. .,: 【】 , , ,. .,:?. . , ,【 】 ,: . .,:?. 【】 ,八 ,.,:., ,辩【】 ,. . .,:.: 【】&博士学位论文. . , : , ,【】 . . :.,.,【】 , , .,. ., :.【】 , , : . .,:.

35、: 【】 , , , .?. .,:?., ,】 .:,., . .,:, , ,【】 .【? . .,:.,【】 .? :,.,:.【】王栋,鹿均先,熊传芝.人脂肪干细胞分离培养鉴定及向成骨细胞诱导分化的实验研究【】.现代医学.,:?. . ,【】 ,. .,:. 【 , ,】 .川.,:.,? , ,【】 .第一章脂肪源干细胞的分离培养及鉴定. .,:. , ,【】 . . ,:?. 【】八 , ,. .:., ,【】八 ? , . ,.:., ,【】 . .: . .,:.?【】: .,:?.】王春雷,吴金鹏,王军,等.筋膜学说解读中医经络实质及针灸作用机制唧.中国中医基础医学杂志.,:

36、.】原林,王军,王春雷,等.人体内新的功能系统一支持储备及自体监控系统新学说【】.科技导报.,:.【】邹丽宜,吴铁,崔燎,等.泼尼松致大鼠骨质疏松症的作用机制研究】.中国药理学通报.,:. .【 】 , , :,. . ,:. ., , ,【】 .,. . , :., ,【】 , 博士学位论文: ? . .,:.【】 :. .,:. ., 【】 ?叨. .,:.【】 , :. 】. ,:. 】 , , , .谢. .,:. .【 , , ,.,:一. : 】 .,:. :, , ,【】 . .【】. . ,:【】土鳖虫含药血清对激素诱导骨髓间充质干细胞成脂和成骨分化差异蛋白组学的影响叨.【】李

37、晓明,曹诚,马清钧.半乳凝集素一与肿瘤形成和转移的关系研究进展】. .生物技术通讯.:【】梁丽娟,谢俊大,赵奎君.蛋白组学在中医药研究中的应用【】.北京中医药.:?.】王放,左雅慧,王小莉,等.辐射致人正常肝细胞蛋白质组电泳图谱的改变【】.辐射防护.:.第一章脂肪源干细胞的分离培养及鉴定【】赵亮.骨髓间充质干细胞和成纤维细胞的蛋白质组学研究】.第四军医大学,.】李菲菲.机械牵张应力对成骨细胞生物特性的影响及蛋白组学研究【】.第四军医大学,.【】热休克蛋白一癌症治疗的新靶点阴.【】陶芳芳,董华腾,何振娟.乳凝集素对脐带血树突状细胞功能的调节作用叨.免疫学杂志.【】仲卫红.土鳖虫含药血清对激素诱导

38、骨髓问充质干细胞成脂和成骨分化差异蛋白组学的影响】.福建中医药大学,.博士学位论文附图图. 第. :“,妻鼍善 ,一?鼍一.量 ,?一一一寸薹鼍山乱吣百 一?。:.:。.。、. .、.。?.: : 约.冬 舅 地仪枪洌 农抗肠、郧?太达,低太达;/表达、一 、 、,;第一章脂肪源干细胞的分离培养及鉴定”.、。,、图.成骨诱导的染色.空白对照 .阴性对照:成骨向诱导 .成骨诱导染色.:.图 成骨诱导的茜素红染色.空白对照组 .阴性对照:成骨向诱导 .钙结节茜素红染色. . :?.图大鼠成脂诱导油红染色.空白对照组 .阴性对照:成脂向诱导 .脂肪滴油红染色.:、析.圃博士学位论文第二章 异体脂肪源

39、干细胞移植对大鼠骨质疏松骨组织微结构的影响 。糖皮质激素在临床上的应用日益广泛,糖皮质激素性骨质疏松.,已成为临床最常见的继发性骨质疏松,易引起病理性骨折,致残率高【.】。由于其发病机制复杂,目前尚无确切的治疗方法【】。根据“筋膜学,理论【.刀:人体是由尚未分化的非特异性结缔组织的筋膜支架构成的支持与储备系统和被该支架支持与包绕的已分化为功能细胞构成的功能系统共同组成。支持与储备系统能够为功能系统中各种功能细胞的代谢和更新提供源源不断的营养供应和细胞支持,当某种功能细胞在代谢过程中未能及时得到未分化干细胞的补充,机体就会出现相应的病变。骨质疏松,是由于骨组织代谢过程中,在一定条件下,骨吸收后,

40、未分化干细胞未能及时分化为成骨细胞,使骨形成不足而导致的一种疾病。因此,通过增加未分化干细胞,使成骨细胞得到有效补充而促进骨形成,可以为骨质疏松的治疗提供一种新的尝试。脂肪源干细胞.,是筋膜组织中未分化干细胞的一种主要细胞储备形式【。本实验通过尾静脉异体移植同源异体的,利用骨组织形态计量学技术,观察其对大鼠骨组织微结构的影响。材料与方法.实验动物本实验大鼠均由广东省南方医科大学实验动物中心提供合格证号:粤.。只雌性大鼠级,质量为,进行适应性喂养周后,随机平均分为空白对照组组、模型组组、治疗组组和治疗对照组组,每组只。.主要试剂和仪器第二章异体脂肪源干细胞移.大鼠骨质疏松骨组织微结构的影响博士学

41、位论文.图像分析软件 公司,德国培养瓶 公司,美国.超净工作台公司,日本二氧化碳培养箱 公司,德国.低温离心机公司,美国.倒置相差显微镜公司,日本数码相机 公司,日本重型切片机 公司,德国.基本用液的配置洗脱包埋液甲基丙烯酸甲酯阻滞剂的配置将甲基丙烯酸甲酯,倒入分液漏斗中;加入% ,充分混匀,静置,待出现分层,放掉下层废液重复次;再加蒸馏水,充分混匀,静置,待出现分层,放掉下层废液,共进行次;将上述处理过的甲基丙烯酸甲酯放入无水氯化钙中脱水;经滤纸过滤,滤液收集于瓶中,置.冰箱,次日取出无冰晶即可备用。过氧化苯甲酰过氧化苯甲酰加入氯仿中,滤纸过滤滴入无水乙醇中,让过氧化苯甲酰结晶。浸液甲基丙烯

42、酸甲酯邻苯二甲酸二丁酯在磁力搅拌器上连续搅拌,下保存备用。浸液甲基丙烯酸甲酯邻苯二甲酸二丁酯过氧化苯甲酰 在磁力搅拌器上连续搅拌,过氧化苯甲酰彻底溶解,下保存备用。第二章异体脂肪源干细胞移植对大鼠骨质疏松骨组织微结构的影响浸液甲基丙烯酸甲酯邻苯二甲酸二丁酯过氧化苯甲酰 .在磁力搅拌器上连续搅拌,过氧化苯甲酰彻底溶解,下保存备用。染液配置粉甘油甲醇将粉末先融入少量甘油中,在研钵体内研磨以上,直至看不见颗粒为止。再将剩余甘油倒入后,于温箱内保温。然后再加入甲醇,搅拌均匀后倒于棕色瓶保存备用。工作液用为.的磷酸盐缓冲液将染液稀释倍。分化液用%乙醇作为分化液。染液配置硝酸银蒸馏水】.的分离培养【周龄雌性大鼠,%水合氯醛/体重腹腔内注射致全身麻醉后,无菌条件下剪取腹股沟部皮下脂肪垫,去除肉眼可见的小血管。液冲洗次以去除红细胞,眼科剪剪碎至大小。加入倍体积的.%型胶原酶,吹打混匀,下间断震荡消化。用等体积的含%胎牛血清的高糖中和,/离心,去除上清,再用含%胎牛血清的高糖重悬细胞,目筛网过滤,四格计数板计数,以/的密度接种于培养瓶中,放置于、%培养箱中培养。后换液,之后每博士学位论文.换液次,待长满融合至瓶底%时用.%胰蛋白酶/.%消化后以:进行传代,倒置相差显微镜下观察。.造模方法动物适应性喂养周后,建立模型【】:组、组和组分别给予颈背部次/周,共周;组分别给予颈背部皮下注射醋酸泼尼松龙注