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1、译文：在间歇反应器内利用类产碱假单胞菌属CECT5344碱性氰化物进行去除以及研究pH对其的影响摘要：含氰废水的毒性可以利用CECT5344产碱假单胞菌菌株在间歇反应器内进行降解。而利用碱性介质进行处理就可以避免HCN的挥发。优化这种操作程序，以此即可用于评估氰化物在不同pH值和溶解氧浓度下的降解性能。在无任何连续调节的情况下，让起始pH值为10，总氰化物的平均去除速率为；然而，这种方法却使得产生HCN的危险性大大增加。最后发现氰化物的消耗是由pH决定的。而这样的话，在pH为10的情况下微生物就无法生存。另一方面，pH为9.5的时候氰化物去除率最多能达到。在高pH值同时低溶解氧（10%）的情况
2、下能够使HCN的挥发降低到最小。这个研究对废水生物处理提供了一个新的基本知识，这又为那些最初利用物化方法净化含氰化物及氰基金属配合物废水提供了一个有效的选择。关键词：氰化物 假单胞菌 间歇式发应器 生物降解 废水1. 简介氰化物在化工领域十分重要，它在采矿业（黄金提取），电镀行业以及其他工业领域内使用产生量巨大。这些行业排放大量的含氰废液，而这些废液含有大量重金属并且毒性大，危害性显著。例如，西班牙的科尔多瓦市，其珠宝行来每年产生大约10吨的碱性废液（pH大于13），其中包括的游离的氰化物尝浓度就高达20mg/L(ca. 0.77M)，而这还不算其中大量的氰和一些金属（Fe, Co, Cu,
3、Ni, Zn Ag, V and Au)的配合物。氰化物在环境有多种存在形式，包括HCN，简单无机盐（NaCN，KCN），以及与金属的配合物，硫氰酸盐类，有机氰化物或腈类。其毒性自身的特有结构决定。因此，游离氰化物对于新陈代谢来说毒性大，危险性高，而对与金属的配合物而来说，其毒性则由氰从其中释放的难易程度决定。游离氰化物的毒性随着pH降低而增大；实际上，共酸形式HCN的毒性是其离子形式CN-的2.3倍。氰化物的毒性效应是通过至少三种人们所知的机制表现出来的，这些机制涉及几种物质的形成：第一，在金属酶的活性部位与二价或三价金属形成配合物，比如细胞色素氧化酶。第二，席夫碱中间体在酶催化过程中引起稳
4、态腈衍生物生成或者第三，与代谢残留的柄酮生成腈醇。由于过去的工业活动以及意外泄露，世界上有无数地方被氰所污染。含氰废水没有经过事先预处理，将其中氰化物的含量减少到很低水平（小于1mg/L）是不许随意排放的。富含氰化物的废物通常利用物理和化学方法将氰化物转化为毒性更低的物质。通常广泛应用的去除毒性的方法涉及到化学氧化。比如在碱性条件下加氯氧化就是如此，利用这种方法可以将富含氯的物质最初转化为毒性更低的氰酸盐，而这些氰酸盐能在继续加氯的情况下进一步被氧化。尽管这种方法在降低富含游离氯的废水的情况下会很有效，但也存在一缺点。因此，在处理金属氰配合物的时候，其低活性会使得加氯氧化无效。而且，这种工艺也
5、会产生污泥，并且需要授权处理；加上由于需求大量的氯，其自身成本也增加；此外，这还会导致一此有害有机化合物生成。其他一些方法包括利用SO2或气态化合物（国际镍公司悬浮熔炼法），铜催化过氧化氢氧化法，臭氧氧化法，铁沉淀法以及电解分离法。然而，这些方法的成本都非常高关且需要特殊设备和专门维护。因为目前没有一个物理或化学方法能为人们完全接受，因此人们迫切需要发展一个低成本，能有效降解氰化物的工艺。微生物方法相对于传统工艺而言(生物降解和生物修复)会是一个潜在的低成本，环境友好型方法。利用微生物降解氰化物相对物理和化学方法而言有很多优势，其中就包括：就地处理成本低；能完全地将有毒物质传化自然地无毒派生物
6、。然而，在通过合适的试点研究之后，其工艺的发展及由试验点向全工业领域推广过程中，我们要做的还有很多。尽管氰化物对生物体有害，但自从一些能通过酶反应代谢氰的微生物被发现后，相对于传统化学方法而言，在去除氰化方面，生物方法仍然是一种可行的选择。首次用微生物去除氰化物是在哈母斯特克（美国南达科他州）的一个金矿业上。自那以后，利用微生物降解氰就成为很多研究者在实验室、飞行行业及各方面的研究主题。而至今在这方面所遇到的最大因难就是对微生物大多数酶而言，需要中性pH才能发挥其最优良活性，而这对去除富含氰化物的物质而言，却是不合适的，因为能常在碱性条件下，氰化物的去除效果才最好。有些学者成功地在中性或酸性条
7、件下利用微生物降解了氰化物；也许，一些微生物菌珠在碱生氰化物中能生存，但在这种条件下却不能进行有效地降解。在之前的研究中，我们分离并标识了一类微生物菌株产碱假单胞菌CECT5344，这类菌株能够在碱性条件下以氰化物作为唯一氮源进行生长。在这项工作中（这项工作只是另一更综合优化研究的一部分），我们用产碱假单胞菌珠CECT5344在批式反应器中，于碱性条件下处理富含氰化物废水，并考察了各类与微生物成长相关的变量（比如供氧，pH）对其去除效率的影响。2.材料与方法2.1化学药品氰化钠（NaCN，纯度大于97%），氯化铵（99.5%）和醋酸钠（99%），这些是由美国的SigmaAldrich公司提供。
8、氮则从法国巴黎的Air Liquid公司购买。而其他用于研究的化学药品是分析级的。将所有这些药品溶于超纯水中制成溶液，这种超纯水是用从贝特福特的密里博公司引进的超纯水系统制备。2.2.微生物及其生长条件嗜碱并以含氰化合物为营养的产碱假单胞菌株CECT5344能在LB培养基上培养。此外，它还能够在加了50mmol/L醋酸钠（作碳源）和2mmol/L氰化钠或氯化铵（作单一氮源）基本培养基上培养。通过加入0.1克当量浓度的NaOH调节培养基的pH为9.5至10。常备的200mmol/L的NaCN溶液通过在NaOH调节下溶入NaCN制成。而固体培养基则是由比重为1.5%的细菌琼脂粉制成。在New Br
9、unswick Scientific C24型号的轨道细菌培养器中，保持有氧条件，30C，调节转速为250r/min，此类细菌通常能正常生长。培菌液需加在100ml的锥形瓶中，其容量为锥形瓶总容量的10%，制成后，将其在30C，转速为250r/min条件下进行培养。最后种菌的纯度则在培养皿中进行检测。2.3.细菌生长的检测对菌种生长进行状况检测有三种方法，即：一，检测在600nm光波长条件下的吸光度；二，在富含LB培养基基质的固体培基经稀释10倍后，在平板上计量菌落的形成单位数，其单位为CFUmL-1。三，将5mL的培养液样本经WhatmanTM 一号滤纸过滤，并与100C下干燥至恒重，称细胞
10、干重，单位为g cell/L。2.4.分批培养条件该实验在Biostat B类发酵罐外加容量为5L的生物反应器内进行（见图示1）。其操作程序如下：反应器装满了营养物质，包括50mmol/L醋酸钠（碳源）和2mmol/L氯化氨（氮源）。反应器及其基质需经过高压蒸气灭菌，且其中不能含有MgSO4和 FeSO4，这就需在先高压蒸气灭菌后，经过滤，然后再加到基本培养基液中制成。在产碱假单胞菌于基本培养基（其中含有2mmol/L的氯化铵作为氮源）经24小时培养后，有5mL的培养液被消耗掉了；这种培养液在培养之初时菌量大约为3105 CFUmL-1，其干重为0.010 g cell L-1，然而在经过24
11、小时其铵盐被消耗完后，NaCN原液则要按所需氰浓度为45mg/L的量加入容器中进行培养。培养温度保持在30C，起始pH利用NaOH调节为9.5至10。在开始培养后，通过自动添加0.1克当量浓度的NaOH调节pH值。培养过程中需不断以450r/min速度搅拌。通过利用可消毒的氧分压探针以及利用脉冲空气控制阀促进曝气的生物反应器主控装置来使溶解氧保持在35%或10%。为了防止HCN的泄露，反应器内的排气冷却器与含有较高浓度NaOH溶液的洗瓶相连。若瓶内溶液中氰化物较少，则说明曝气程序效果较好。2.5.分析方法铵离子可用泰斯勒试剂进行定量，而氰化物则可用比色法进行定量。2.6.数据统计所有标绘数据是
12、三组独立实验的平均值。其平均标准偏差不超过3%。 图1图1说明：生物反应器示意图。批量实验在发酵罐与反应器内进行，反应器是一个最大容量为5L的玻璃量杯，其上有盖以保证密封条件。通过搅拌使内部溶液混合。其气体处理系统由转子流量计和电磁阀组成。该系统通过回流泵或水浴使温度保持在30C。pH则通过蠕动泵添加基本溶液来调节。该系统配有pH计，氧分压探针及温度计。通过MFCS或DA软件来进行视图化，数据采集，以及展现发展趋势。3.结果及分析在这项研究中，我们检测了在含有氰化物的批式反应器中pH和溶解氧对这类嗜碱性的产碱假单胞菌珠CECT5344生存能力的影响。这类菌珠能在pH为11.5，氰根浓度达780
13、mg/L的溶液中生存。我们通过一系列实验来检验pH的影响，其起始pH为均为10，之后就不再对pH进行控制。在经过140小时后，检测到氰化物明显降解及微生物显著生长。图2A-C表明了氰化物，铵离子，溶解氧，pH几者变化同微生物生长之间的关系。为了避免由气提引起溶解氧不足及HCN的挥发，将溶解氧浓度设置在35%（图2B）。在这种条件下，CN浓度为45mg/L的废水，其氰化物在57.6小时后均被去除（平均支除速率为0.78mgCN L1 h1)，这相当于氰的平均消耗率为2.81mg CN L1 O.D.1 h1（图2A）。从图2B中可以看出，溶解氧浓度及pH值的降低是产碱假单胞菌分解氰化物引起的结果
14、。因此，pH值由初始的10降到终约为7.5；然而，在pH降至9之前，已经有大约60%的氰化物被降解。因此，氰的降解是主要发生在pH为9至10之间。很多微生物以能够在碱性条件下降解氰化物为人们所知。因此，人们发现， 腐皮镰刀菌的一类真菌菌株IHEM 8026经过96小时后，于碱性条件下能够降解浓度为50mg/L的氰化物（平均速率为0.52mgCN L1 h1），但是基质中酵母提取物浓度达125mg/L。该氰化物的降解速率同此文中菌珠CECT5344能降解的速率相似，但是前者需要酵母提取物的存在。同样，洋葱假单胞菌属在pH为10时也能降解氰化物，但需要葡萄糖作为碳源。此外，葡萄糖与氰能发生化学反应
15、，因此葡萄糖作为碳源行不通。斜生珊藻也能有效降解氰化物，在初始pH为10.3时其降解速率能达0.10mg CN L1 h1，且无需后续控制。但这可能会导致HCN逸出。有些学者已成功在中性条件下利用假单胞菌属对氰化物进行生物去除。培养液中含有酵母提取物(Kin BTM)和甘油，并以此作为碳源。然而，在这种情况下，氰化物的生物降解实际上决定了其化学转化。微生物的生长，是以菌落形成单位CFU，吸光度（波长为600nm）和干重来表达。这三种类形表达了相似的变化形式（图2C）。在将氰化物加到氨增长型细胞中时，出现了很长一段迟滞期。实际上，在这个阶段中，并没有发现任何的增长现象，但是氰化物确实有被去除，且
16、氰化物浓度被降低到了约30mg/L。在这初级阶段中，也许会要求引出一些导致氰降解的理论现象，比如对氰不敏感的呼吸作用，以氰化物形式来获取铁的载铁体机制，以及涉及生物降解路径的特定酶或代谢中间产物等。正如后面所说，迟滞期受pH影响很大，其后伴随着指数增长，并且在加入氰化物60至80小时后，能达到最好的去除效果。而氰化物去除的同时，伴随着细菌的对数生长期以及氧消耗量的大幅增加。图2图2说明：在无后续pH控制下，类产碱假单胞菌CECT5344于pH为10时对氰化物的去除。(A)铵与氰化物消耗量（B）pH变化与氧 (C)600nm光波长下，测量吸光度检测到的细菌生长（CFU mL-1，DW g cel
17、l L-1）。在经过24小时，氮源（氯化铵）被消耗掉后，加入氰化物（45mgL-1）。初始pH为10但无需后续控制。正如图3所示，细菌生长和氰化物的去除始终密切相关。因此在各种模式下，包括连续性操作，这一菌株似乎在降低含有氰化物废水毒性方面会十分有效。培养液中加入的氰根（作为单一氮源）浓度为45 mgL-1时，我们发现，当YX/CN 值为5.9 O.D. (600 nm) g1 CN时，另两个参数分别为3.58 g cell L1 g1 CN，1.191010 CFUmL1 g1 CN。这些数值与氰化物的去除产量0.17 g CNO.D. (600 nm)1, 0.28 g CN g1 cel
18、l L， 8.41011 gCN CFU1 mL是密切相关的。图3图3说明：该菌株能去除氰化物。菌生长量表示方法有吸光度用（）表示，干重用（-）表示，以及菌落形成单位CFU用（.）表示。该菌是在含氰的批式反应器中，初始pH为10且无后续控制情况下进行培养，并以氰去除效益（g/L）展现出来，最终得出该线性图形从动力学上来讲，对于指数生长阶段，我们可以假定是在一级动力学（）的情况下，通过细胞的物料平衡来估算其特有生长速率。其中X代表细胞浓度，Xi代表对数成长初期的细胞浓度。代表在时间点t时的生长速率。实际上，正如图4所示，最终获得的直线图形与细胞浓度表达方法无关，而其细胞比生长速率最终测得为0.0
19、74 h1若以这个速率来唐预测，菌株CECT5344所需时间会是9.4小时，这将会高出以氰酸盐，铵，硝酸盐作为氮源时所需时间的两倍。在之前的研究工作中就发现，恶臭假单胞菌株CP1在含对氯笨酚的废水中，其比生长速率为0.013 h1。而一种类产碱假单胞菌株KPN在优化条件，并以吡啶作为碳源和氮源时，其比生长速率为0.2 d1。待添加的隐藏文字内容2图4图4说明：该图适用于细胞生长符合一级动力学规律的菌珠。展示了ln (X/Xi)值与时间变化之间的关系。共中X表示细胞浓度，Xi表示初始细胞浓度：（）表示lnO.D. 600 nm/O.D. 600nmi ，（）表示lnDW/DWi，而()表示lnC
20、FU/CFUi。图5图示5说明：展示了产碱假单胞菌珠CECT5344在pH控制为10时对氰化物的去除效果。A图表示铵和氰化物。B图为pH变化和溶解氧。C图为在波长为600nm下的监测到的细菌成长过程中的吸光度。当氮源氯化铵被消耗后，调节并保持持续pH为10直到500h后，取消对pH的控制。图6图6说明：展示了产碱假单胞菌CECT5344在pH控制在9.5时对氰化物的降解效果。图A为铵和氰化物的消耗，以及在波长为600nm下的监测到的细菌成长过程中的吸光度。B图为pH变化及溶解氧饱和度。在24小时后，氯化铵消耗尽时，加入浓度为45mgL-1的氰。整个过程中保侍pH为9.5。在氰的生物降解方面，p
21、H是一个重要的影响因素。实际上，为了提高这种生物工艺降解的安全性和有效性，需要在较高pH条件下以防止HCN（pKa = 9.2)的形成。这就使得我们必需在一个持续叫高pH值的条件下来评价菌体的生长和氰的同化。因此，如第二部分描述的那样，细胞会提前成熟，并且在加入氰化物后，pH会调节并保持在10左右（图5，在时间为500h时）。从图5C中可以看出，尽管在这种条件下细胞生长会受抑制，但其浓度仍保持在5108 CFUmL1左右。图2中情况也类似，我们发现有些氰化物在迟滞期就被消耗掉了，氰化物浓度由45mgL1降至30mgL-1，但是控制pH并不能够满足氰化物的进一步降解（图5A所示）。其中还发现溶解
22、解浓度的微量变化（如图5B所示）。另一方面，不控制pH变化（图5中从500h至最后）时，细菌在生长的同时也伴随着氰化物的去除。尽管持续的高pH（10)条件会使其生物降解效率偏低甚至根本无法降解，但该微生物始终能够生存，并且在该条件下能何持一定量的浓度。这个结果表明，pH值变化需在有控范围内以确保氰化物的完全降解，并同时防止氰化氢的析出。这就使我们要在控制pH为9.5时检测来氰化物的降解程度，在这个过程中，溶解氧饱和度也应始终保持在10%左右（低于之前）。同之前一样，在铵有限的情况下，细胞提前成熟。利用这个程序，氰化物在经69.1h之后去除量为44.9mg/L，其去除平均速率约为0.64mgCN
23、 L1 h1，相当于2.31mgCN L1 O.D.1 h1（如图6A所示）。其最后获得的值只是比在第一个实验中初始pH为10.0，无后续调节及氧饱和度为35%时稍小一点。然而，这两个实验在统计学上基乎没什么差异。比较图2和图6就可以发现，在氰化物的消耗和细胞生长分布图上，二者还是有所不同；而且，pH也对其处理效果有显著影响。从图2A和C中可看出，当初始pH为10时，会引发迟滞期的出现，并一直到pH降为9.5时为止。另一方面当初始pH调为9.5时，则不会有迟滞期的出现（如图6A和C）。无论哪种情况，结果均表明：利用持续pH为9.5及10%的氧饱和度能够使氰化物的降解速率与在无pH控制，氧饱和度
24、为35%时相同。此外，由于pH较高，以及溶解氧浓度低，因此HCN的逸出危除性就大大降低。4结论我们发现，在载有含醋酸盐作为碳源的基本培养基的批式反应器中，当控制在碱性条件下时，产碱假单胞菌属CECT5344降解氰化物的速度能达到0.64mg CN-L1 h1（相当于2.31mg CN L1 O.D.1 h1）。氰化物的降解受pH的影响很大，因此必需对pH进行严加控制。而持续pH维持在10对于生物降解反而不利，这需要使初始pH为10并无后续控制也不是始终维持pH为9.5。利用高pH和低溶解氧可降低氰化物挥发的风险。在当今要求无化学预处理的情况下，相对于用物理化学法降低含氰或金属氰配合物废水的毒性而言，在批式反应器中，使持续pH为9.5的情况下，利用菌株CECT5344去除氰化物会是一个更有效的选择。致谢这项研究是由西班牙的科学与技术部，安达鲁西亚委员会，以及埃斯特雷马杜拉委员会的资助下进行的。其中还有S.L. Gemasur，S.L.Saveco和S.L. Avenir之间的合作也起了很重要的作用。此外，V.M. Luque-Almagro承认了来自科学技术部的博士后合约中的以鹿后肢形式进行的资助。Socorro Murdoch教授在论文准备期间对自己提出了宝贵的建义，对此作者非常感谢。
