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1、水中的细菌总数测定,培养基的配制消毒与灭菌水中细菌总数的测定菌落计数法,（一）实验目的（二）实验原理（三）实验器材（四）实验方法（五）实验作业,培 养 基 的 制 备 与 灭 菌,（一）实验目的,1、明确培养基的配制原则；2、掌握配制培养基的一般方法和步骤；3、了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围；4、掌握高压蒸汽灭菌技术，了解几种常用灭菌方法。,（二）实验原理,培养基是按照微生物生长繁殖或积累代谢产物所需的各种营养物质，用人工方法配制而成的一种基质。它包括碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水六类营养要素。由于不同微生物细胞组成不同，因而所需营养基质不同，为了分离、培养和鉴定不同的微生物，必
2、须根据其需要，配制合适的培养基.培养基的种类繁多，根据培养基的成分、物理性状不同，可分为天然培养基、合成培养基、半合成培养基、固体培养基、半固体培养基和液体培养基。,常用加热灭菌法：1、干热灭菌：用火焰烧灼或电热干燥箱内高温热空气灭菌2、湿热灭菌 高压蒸汽灭菌法 间歇灭菌法 煮沸消毒法,灭菌是指应用物理或化学的方法，杀灭物体表面和内部一切微生物营养体、芽孢和孢子。灭菌方法很多，可分为加热、过滤、照射和化学药品法等。,（三）实验器材,1.药品和试剂：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、10NaOH溶液、10盐酸溶液。2.器材：天平、药匙、瓷缸、玻璃棒、电炉、PH试纸、试管、三角瓶、分装漏斗、牛皮纸、棉花、
3、线绳、干燥箱、高压锅。,1.称量按照培养基配方，准确称量各成份放于瓷缸中。配方：牛肉膏5.0g,蛋白胨10.0g，NaCl5.0g,琼脂20.0g,蒸馏水1000ml,pH7.0。,（四）实验方法,培养基的制备过程称量-溶解-调节pH值-过滤-分装及包扎-灭菌-灭菌后试管摆放斜面,2.溶解向上述瓷缸中加入所需要的水量，搅拌，加热使其溶解。如是配制固体培养基，在琼脂的熔化过程中，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。待完全熔化后，补足所失水分。3.调节pH值用玻璃棒沾少许液体，测量PH值。用氢氧化钠和盐酸调节PH。,4.过滤用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求可省去。5.分装及包扎根据不
4、同的需要，可将制好的培养基分装入试管内（用分装漏斗）或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。最后用牛皮纸将棉塞部分包好。,6.灭菌：高压蒸汽灭菌，1210C灭菌20分钟。,7.灭菌后试管摆放斜面,注 意 事 项,1、称取药品时严防药品混杂，一把牛角匙称一种药品；2、蛋白胨极易吸湿，称取时动作要迅速；2、配制固体培养基时，先将其他药品加热溶解到快沸时，再将称好的琼脂加入，继续加热至琼脂完全熔化，此过程要不断搅拌，以免琼脂糊底，并控制火力，防止沸腾外溢；4、分装量根据试管大小和实际需要而定，固体培养基装量约为管高的1/5，液体培养基的装量约为管高的1/4，三角瓶的装量不超过瓶体的1/2；5、分装过程中注意
5、不要将培养基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污染。,返 回,（五）实验作业,为什么湿热灭菌比干热灭菌法更有效？,消毒与灭菌,1干热灭菌法 2高压蒸汽灭菌 3紫外线灭菌法,（二）高压蒸汽灭菌 1、原理 利用加热一个密闭的加压灭菌锅，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。一般培养基用0.1Mpa，121.5,1530min 2、步骤,加水,装待灭菌物品,加盖,加热,灭菌时间到后断电源,压力降为零开箱取物,（三）紫外线灭菌法1、原理 紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的
6、形成和DNA 链的交联，从而抑制了DNA 的复制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成O，再使O2 氧化生成臭氧或使水氧化生成H2O2。O3 和H2O2 均有杀菌作用。适用于无菌室，接种箱，手术室内的空气及物体表面的灭菌。,2、步骤 1）单用紫外灯 在无菌室内或在接种箱内打开紫外线灯开关，照射30min，将开关关闭。2）化学消毒剂与紫外线照射结合使用 在无菌室内，先喷洒化学消毒剂溶液，再用紫外线灯照射15imn,水中细菌总数测定,一、水样的采集,1.采水容器,采样瓶：具磨口玻塞的500mL广口瓶,采样瓶的洗涤,采样瓶的灭菌:160170干热灭菌2h，或用高压蒸汽灭菌器，121灭菌15min,
7、一、水样的采集,2.采样步骤及注意事项,(1)去氯和高浓度重金属：灭菌前按500mL采样瓶加入0.3mL10%Na2S2O3溶液,(2)采集江、河、湖、库等地表水样时，可握住瓶子下部直接将已灭菌的带塞采样瓶插入水中，约距水面1015cm处采集,（3）采集一定深度的水样时，可使用单层采水器或深层采水器,（4）从自来水龙头采集样品时，采水前可先将水龙头打开至最大，放水35min，用酒精灯火焰灼烧约3min灭菌,（5）在同一采样点进行分层采样时，应自上而下进行，以免不同层次的搅扰；同一采样点与理化监测项目同时采样时，应先采集细菌学检验样品,（6）采样完毕，做好记录,二、样品保存,采好的水样，应迅速运往实验室，进行细菌学检验。一般从取样到检验不宜超过2h，否则应使用10以下的冷藏设备保存样品，但不得超过6h,细菌总数的测定,细菌总数：指lmL水样在营养琼脂培养基中，于37培养24h后，所生长细菌菌落的总数。,一、细菌总数测定的意义,可以反映水体有机污染的程度,生活饮用水的细菌总数lmL不得超过100个,细菌总数的测定,二、培养基的制作,三、测定方法及步骤,1.稀释水样,2.接种水样,3.培养：37下倒置培养24h,细菌总数的测定,三、菌落计数,细菌总数的测定,四、计算和报告计数结果,
