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1、基因芯片及其应用,内 容,背景原理应用,背 景,基因分析芯片开发的动力：1.遗传信息迅猛增长 随着人类基因组（测序）计划（Human genome project）的逐步实施以及分子生物学相关学科的迅猛发展，越来越多的动植物、微生物基因组序列得以测定，基因序列数据正在以前所未有的速度迅速增长。然而,怎样去研究如此众多基因在生命过程中所担负的功能就成了全世界生命科学工作者共同的课题。为此，建立新型杂交和测序方法以对大量的遗传信息进行高效、快速的检测、分析就显得格外重要了。,2.相关学科与技术的高度发展和相互渗透 当代与信息产业相伴随的计算机、精密机械等科学技术是大规模解析基因信息的基础，而基因芯
2、片从实验室走向工业化却是直接得益于探针固相原位合成技术和照相平板印刷技术的有机结合以及激光共聚焦显微技术的引入。它使得合成、固定高密度的数以万计的探针分子切实可行，而且借助激光共聚焦显微扫描技术使得可以对杂交信号进行实时、灵敏、准确的检测和分析。,3.科学的发展人类的进步要求进行大规模基因信息的解析 鉴于基因芯片的多种用途和其远大的发展前景，不少生命科学研究机构和生物技术公司都先后参与了这项技术的研究。据不完全统计目前仅国内就有十多家单位从事该技术的研究与开发工作，全世界估计至少有二三十家。它已象半导体技术一样成为一个重要的产业方向。当前已正被广泛地应用于诸多领域，包括生物医学、临床诊断学和基
3、因组学研究。,一、概 念,生物芯片 主要指通过平面微细加工技术在固体芯片表面构建的微流体分析单元和系统，以实现对细胞、蛋白质、核酸以及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。基因芯片 最重要的一种生物芯片。生物芯片 是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命。,原 理,基因芯片 技术是通过微阵列技术,将高密度DNA片段阵列通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标记的生物样品，借助互补杂交原理，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息进行大量的基因表达及监测等方面研究的最新革命性技术。微阵列 技术巨大优势在
4、于它可以并行地宏量获取生物信息，借助此技术发展的生物芯片则提供了以核酸杂交为基础的基因水平的表达监控，多态性研究和Genotyping。从而使我们对基因表达调控有更深入的了解。,基因芯片的重要性可以与50年代 把单个晶体管组装成集成电路芯片相比，它将会对廿一世纪生命科学 和医学的发展产生无法估计的影响。,基因芯片发展历史,二、原 理,基因芯片(Gene Chip,DNA Chip)，又称DNA微阵列(DNA Micorarray)，是指按照预定位置固定在固相载体上很小面积内的千万个核酸分子所组成的微点阵阵列。在一定条件下，载体上的核酸分子可以与来自样品的序列互补的核酸片段杂交。如果把样品中的核
5、酸片段进行标记，在专用的芯片阅读仪上就可以检测到杂交信号。,基因芯片是在基因探针的基础上研制出的，所谓基因探针只是一段人工合成的碱基序列，在探针上连接一些可检测的物质，根据碱基互补的原理，利用基因探针到基因混合物中识别特定基因。它将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析。基因芯片通过应用平面微细加工技术和超分子自组装技术，把大量分子检测单元集成在一个微小的固体基片表面，可同时对大量的核酸和蛋白质等生物分子实现高效、快速、低成本的检测和分析。,基因芯片技术的主要特点:技术操作简单 自动化程度高序列数量大检测效率高应用范围广成本相对低,DNA
6、Chip Technology,Solid support(glass,membrane,plastic,silicon)Miniaturized array of DNA(genetic material)Work on the biochemical principle of DNA/DNA hybridizationHybridized probes(DNA molecules)are fluorescently labeled,基因芯片技术主要包括四个主要步骤：,2、样品制备 生物样品往往是复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应，有时样品的量很小。所以，必须将样
7、品进行提取、扩增，获取其中的蛋白质或DNA、RNA，然后用荧光标记，以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。荧光标记为最常用的方法，优点是无放射性且有多种颜色可供使用,1、芯片制备 目前制备芯片主要以玻璃片或硅片为载体，采用原位合成和微矩阵的方法将寡核苷酸片段或cDNA作为探针按顺序排列在载体上。芯片的制备除了用到微加工工艺外，还需要使用机器人技术。以便能快速、准确地将探针放置到芯片上的指定位置,3、杂交反应 杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行的反应产生一系列信息的过程。选择合适的反应条件能使生物分子间反应处于最佳状况中，减少生物分子之间的错配率,4、信号检测和结果分析 杂交反应后的芯片上
8、各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪和相关软件可以分析图像，将荧光转换成数据，即可以获得有关生物信息,杂交仪(Hybridization station)或杂交盒(Hybridization chamber),检测系统阅读仪(Reader),激光共焦扫描CCD成像,基因芯片原型,三、分类,寡核苷酸芯片cDNA芯片,原位合成法合成后点样法,分类一：,分类二：,（一）、原位合成法：指根据预先设计的点阵序列在每个位点通过有机合成的方式直接聚合得到所要求的探针分子。聚合之后芯片片基的制作即告结束。该方法有两类：光引导原位聚合技术 压电打印原位聚合技术,分类一：,基因芯片在片合成原理图,光引导原
9、位聚合技术简要过程：首先使支持物羟基化，并用光敏保护基团将其保护起来，选取择适当的蔽光膜（mask）使需要聚合的部位透光，其它部们不透光。这样，光通过蔽光膜照射到支持物上，受光部位的羟基解保护，进而与单体分子共价结合。因为合成所用的单体分子一端按传统固相合成方法活化，另一端受光敏保护基的保护，所以发生偶联的部位反应后仍旧带有光敏保护基团。因此，每次通过控制蔽光膜的图案（透光与不透光）决定哪些区域应被活化，以及所用单体的种类和反应次序就可以实现在待定位点合成大量预定序列寡聚体的目的。优点：合成效率高，点阵密度高缺点：设备昂贵，技术复杂，反应产率低,压电打印原位聚合技术其装置与普通的彩色喷墨打印机
10、并无两样，所用技术也是常规的固相合成方法。即，将墨盒中的墨汁分别用四种碱基合成试剂替代，支持物经过包被后，通过计算机控制喷墨打印机将特定种类的试剂喷洒到预定的区域上。冲洗、去保护、偶联等则同于一般的固相原位合成技术。如此类推，可以合成出长度为40到50个碱基的探针。优点：设备廉价，技术相对简单，反应产率高缺点：点阵密度低，易产生交叉污染,（二）、合成后点样法（简称点样法）：合成工作用传统的DNA固相合成仪完成，只是合成后用特殊的自动化微量点样装置将其以比较高的密度涂布于硝酸纤维膜、尼龙膜或玻片上。支持物应事先进行特定处理，例如包被以带正电荷的多聚赖酸或氨基硅烷，以便能够牢固地结合寡核苷酸分子。
11、该方法是目前大多数中小型公司所采用的方法。优点：设备廉价，技术简便，研制周期短，灵活 性高缺点：点阵密度低,原位合成法：可以发挥微细加工技术的优势，很适合制作大规模DNA探针阵列芯片，实现高密度芯片的标准化和规模化生产,点样法：优越性在于可以充分利用原有的合成寡核苷酸的方法和仪器或cDNA探针库，探针的长度可以任意选择，且固定方法也比较成熟，灵活性大适合于研究单位根据需要自行制备科研型基因芯片，制作点阵规模较小的商品基因芯片。,（一）、寡核苷酸芯片(Oligonucleotides Chip),概念：是指做在固相载体上的寡核苷酸微阵列。,原位合成（主）预先合成（次）,分类二：,1、美国Affy
12、metrix公司(http:/)专利技术：光引导化学合成法(Light-directed chemical synthesis process)。产品名为GeneChip。,2、Incyte Phamaceuticals5公司(http/)3、Rosetta Biosystem Inc公司基于喷墨打印原理(IN situ synthesis with reagents delivered by ink-jet printer devices)。,原位合成,根据杂交目的确定寡核昔酸探针的长度和序列 计算机设计出合成寡核苷酸时用到的所有光掩膜(Masks)做探针合成,光引导化学合成过程：,优点：可
13、以用很少的步骤合成极其大量的探针阵列，探针阵列密度可高达到每平方厘米一百万个。缺点：一、需要预先设计、制造一系列掩模，造价较高；二、每步产宰较低，因此合成探针的长度受到了限制,（二）、cDNA芯片（cDNA Chip）,概念：在玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等固相载体上固定的成千上万个cDNA分子组成cDNA微阵列。,最常用固相载体:显微镜载玻片,表面处理:,目的:抑制玻璃片表面对核酸分子的非特异性吸附作用。,方法:氨基化法、醛基化法和多聚赖氨酸包被法。,合成后点样法(Spotting after synthesis)（主）,合成后点样法:简称:点样法 专用设备:点样仪(Arra
14、yer)点样仪(Arrayer)计算机系统控制的电脑机械手。点样时电脑机械手利用点样针头(Pin)从96或384檄孔板上蘸取cDNA样品，按照设计好的位置点在载玻片表面。,电子定位法(Electronic addressing)（次）,合成后点样板,基因芯片的主要类型及其简要特点,Two Kinds of DNA Microarrays,Natural DNA(PCR Products)gene expressiongenomic DNA detection,Artificial DNA(oligonucleotide)gene expressionSNP genotypinggene mut
15、ation,on-chip synthesis,Lab on a chip,Microarray,应 用,在实际应用方面，生物芯片技术可广泛应用于疾病诊断和治疗、药物筛选、农作物的优育优选、司法鉴定、食品卫生监督、环境检测、国防、航天等许多领域。它将为人类认识生命的起源、遗传、发育与进化、为人类疾病的诊断、治疗和防治开辟全新的途径，为生物大分子的全新设计和药物开发中先导化合物的快速筛选和药物基因组学研究提供技术支撑平台。,生物芯片的应用,生物学与医学研究基因表达谱、功能基因组等临床诊断和其他生物检测与其他检测手段的竞争个人基因档案个体化医学、药物开发,1 基因表达检测 拟南芥、酵母基因表达研究等2 突变检测 BRCA基因外显子11、CFTR基因、-地中海贫血、酵母突变菌株、HIV-1逆转录酶及蛋白酶基因等的突变检测等3 基因组多态性分析 人类基因组单核苷酸多态性的鉴定及分型，人线粒体16.6kb基因组多态性的研究等4 基因文库作图 通过确定重叠克隆的次序从而对酵母基因组进行作图 5 杂交测序6 Etc.,目前市场情况:,基因芯片:90%药物筛选:40%诊断:10%基因型检测:25%芯片实验室:1%,
