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1、000405,chmjampc,1,细菌耐药研究的进展及对策中山大学附属三院张扣兴,000405,chmjampc,2,抗生素时代细菌耐药性的问题,“The war of Human Vs Bacteria”Who will be the last winner？“生命总会找到出路”摘自“失落的世界”,000405,chmjampc,3,1940-1960年青霉素时代1953年耐药率达80%1960-1978年广谱青霉素和1,2代1970s出现携带多种耐药基因的菌株头孢菌素时代产头孢菌素酶的不动杆菌广泛流行 1978-1995年广谱-内酰胺类时代细菌产超广谱-内酰胺酶(ESBLs和第3，4代头
2、孢菌素Bush I型-内酰胺酶，细菌对三代单环内酰胺类头孢菌素和单环内酰胺类耐药-内酰胺酶抑制剂碳青霉素类 1995-2000年？全球范围内产诱导酶的肠杆菌对头孢他啶和头孢噻肟的耐药率高达20-70%,控制细菌耐药不能单纯依靠研制和开发新型抗生素,Medeiros AA,et al.Clin Infect Dis.1997;24(Suppl):S19-45Sentry Study 2000,-内酰胺类抗生素及其耐药菌发展史,000405,chmjampc,4,000405,chmjampc,5,耐万古霉素肠球菌和金葡菌。耐青霉素肺炎链球菌。多重耐药的结核菌。产ESBLs和Amp C酶菌多重耐药
3、的嗜麦芽窄食单胞菌。多重耐药的绿脓杆菌。人类征服耐药将面临着长期艰巨的任务。根本的办法是合理有效使用抗生素，加强耐药菌的分子流行病学监控，及时阻断耐药菌传播,000405,chmjampc,6,细菌耐药机制,1.产生灭活酶：1)内酰胺酶(最大的一类)2)氨基甙钝化酶等2.靶位改变:PBP的数量或结构改变3.低通透性屏障作用1)膜通透性下降2)生物被膜4.主动泵出(active efflux process)5.细菌缺乏自溶酶，对抗菌药物产生耐受,2023/2/13,蛋白通道：绿脓杆菌、克雷伯菌属、在细菌细胞外膜，不同药物有各自不同的通道，药物通过时通道可关闭。,脂多糖,细胞外膜、细胞壁,细胞膜
4、,OprD2,000405,chmjampc,8,绿脓杆菌 药物渗透屏障耐药,天然对抗生素的通透性降低，比大肠杆菌的抑菌浓度高数十或数百倍：大肠杆菌 绿脓杆菌 庆大 1 4-8 吡肟0.12 1 8 环丙0.01 0.25-2 外膜蛋白高频突变，抗生素屏障作用增强,2023/2/13,主动外排作用(反泵作用)：将范围极其广泛的结构不相关的抗生素或其他有毒物质排出细胞外，以减少药物在细胞周质的积累，从而使细菌产生固有耐药性。1.经典:细胞质 细胞周质2.穿过细胞内膜及外膜,2,细胞外膜、细胞壁,细胞膜,1,2023/2/13,绿脓杆菌有多药泵出系统，至少有 17 种多药泵 常见4种外排系统：Me
5、xAB-OprM，MexXY-OprM，MexCD-OprJ，MexEF-OprN1.绿脓杆菌 MexA（连接蛋白）,MexB（转运蛋白）-OprM（外膜通道）外排系统。,药物,药物,细菌,泵,（绿脓荧光素.环丙沙星.四环素.氯霉素。与抗生素多重耐药有关）,2023/2/13,2.绿脓杆菌 MexC,MexD-OprJ外排系统。,药物,药物,细菌,泵,（b-内酰胺类）,2023/2/13,3.绿脓杆菌 MexE,MexF-OprN外排系统。,药物,药物,细菌,泵,（与抗生素多重耐药有关）,000405,chmjampc,13,绿脓杆菌外膜泵的表达和抗生素的耐药性,菌株 泵 MIC(ug/ml)
6、PAMMexAB MexBC MexEF Levo Fep Cpo Carb Aztr1275-0.03 0.125 0.25 0.5 0.251020(wt)+-0.125 0.5 1 64 2 1032+-1 4 4 256 16 1438+-2.0 4 16 256 162281+-+4-8 4 4 256 162303+4-8 4 8 128 8,Modified from Lee et.al J.Bacteriol 2000,2023/2/13,生物膜形成：绿脓杆菌 克雷伯菌属,细菌形成黏液样物质（藻酸盐）保护细菌不受药物作用且避免吞噬细胞吞噬，长期潜伏在病灶处。,藻酸盐,绿脓杆菌,
7、000405,chmjampc,15,生物被膜的耐药机制,1.弥散屏障2.延缓生长3.各区域生物被膜细胞不同耐药基因的表达,2023/2/13,靶位蛋白的改变耐药金葡、耐药表葡、耐药肺炎链球菌的膜青霉素结合蛋白（PBPs）结构改变，并与-内酰胺药物亲合性下降。,PBPs是合成细胞壁终末阶段的酶。MRSA:PBP2aDRSP:PBP改变（PBP1a PBP1b PBP2x PBP2a PBP2b PBP3）敏感菌和耐药菌基因整合使之在种属间水平传播造成大流行。,000405,chmjampc,17,内酰胺酶-最主要的灭活酶,1.到目前已发现200多种；2.新的种类不断发现；3.对内酰胺类抗生素造
8、成威胁。,000405,chmjampc,18,B-内酰胺酶分类,按结构功能活 性 棒酸Ambler Bush 头孢噻肟 氨曲南 IMP 抑制A2a-+2b-+2be+-+2br-2c-+2e+-+.2f+C 1+-D2d-+/-?4v-B 3+-+-,000405,chmjampc,19,针对内酰胺酶的对策,1.侧链加笨重的基因(Bulky chain)：一代三代2.复合制剂：酶抑制剂只解决了部分问题3.发现新的抗菌药物-碳氢酶烯类等4.正确使用抗菌药物,000405,chmjampc,20,000405,chmjampc,21,ESBLs的发现和流行,1982年英国发现一株耐头孢他啶的产酸
9、克雷伯菌，与TEM-1相比仅有一个氨基酸的差异1983年德国发现首例 ESLBs的臭鼻克雷伯菌(SHV-2)，与SHV-1相比，仅有一个氨基酸的差异1992年法、英、葡医院分离出的KP中有14%16%产ESBL，而在EC中的比例仅为0.1%,000405,chmjampc,22,ESBLs的发现和流行,19921996，美国一医院的EC和KP的检出率分别为 1%和4%；1996年另两家医院ESBL的检出率分别是35%和42%ESBL除南极洲外均有发现。欧洲以TEM-3为主，美国以TEM-10,12,16为主，而SHV-2,5似乎世界内流行1997年瑞士发现SHV亚型韩国报道存在产SHV-11,
10、2的细菌90年代以来，已成为全球性问题,000405,chmjampc,23,ESBLs的发现和流行,香港：90年：ECO(1.6%)KL-(2.8%)EN-(24.1%)95年：ECO(2.6%)KL-(10.8%)EN-(22.7%)广州：95年：ECO，KPN(5%，ICU，默沙东)96年：ECO(18%)KPN(19%)EN-(16%)98年：ECO(40%)KPN(38%)EN-(38%)2000年后？,000405,chmjampc,24,北京：CTX-M-3，11上海：CTX-M-3广州：CTX-M-3，11杭州：CTX-M-3，9，13，14，15，22,中国ESBL的主要基因
11、型,000405,chmjampc,25,ESBL 基本概念,细菌一旦产生此类酶，临床上对所有青霉素类、头孢类和单酰胺类抗生素耐药，而对碳青霉烯类和头霉烯类较为敏感对酶抑制剂敏感,000405,chmjampc,26,ESBLs的基本概念,主要由克雷伯菌和大肠埃希菌产生；为丝氨酸蛋白酶衍生物，水解内酰胺环体外试验：对三代头孢和氨曲南抑菌环缩小，但不一定在耐药范围加入克拉维酸可使抑菌环扩大临床对内酰胺类耐药，对碳青霉烯类和头霉烯类药物敏感由质粒介导，往往由普通的内酰胺酶基因(TEM-1、TEM-2、SHV-1)突变而来，能水解氧亚氨基-b-内酰胺抗生素，目前已有1百多种，多重耐药,000405,
12、chmjampc,27,ESBLs的靶抗生素,头孢泊肟(cefpodoxime)(CPD)*安曲南(aztreonam)(ATM)头孢他啶(ceftazidime)(CAZ)头孢噻肟(cefotaxime)(CTX)头孢曲松(ceftriaxone)(CRO),000405,chmjampc,28,ESBLs的代表性菌株,大肠埃希菌肺炎克雷伯菌粘质沙雷菌弗劳地枸橼酸菌阴沟肠杆菌铜绿假单胞菌等,000405,chmjampc,29,广谱酶(TEM-1，TEM-2，SHV-1)主要灭活青霉素和窄谱头孢菌素(一、二代头孢)，三代头孢菌素对其稳定 ESBLs能分解三代头孢(头孢噻肟、头孢他啶、头孢哌酮
13、、头孢曲松)以及单环酰胺类的氨曲南，但大多数产ESBLs菌株对复合制剂(如特治星、舒普深)敏感，几乎所有产ESBLs菌株对泰能敏感,产ESBLs菌株的耐药特点,000405,chmjampc,30,头孢他啶可以选择出产生ESBLs的菌株产生ESBL的病人53%曾经在前一个月使用过头孢他啶在ESBL爆发流行之前头孢他啶的用量是以前的六倍头孢他啶治疗中性粒细胞减少性发热的儿科肿瘤病房发生ESBL爆发流行 Ann Intern Med 1993,选择产生ESBLs的危险因素,000405,chmjampc,31,ESBL基因型已经发现了150多种,TEM 65SHV 38OXA 15CTX-M 23
14、其他型10,000405,chmjampc,32,产ESBL的大肠杆菌、克雷伯菌的敏感性*,抗生素大肠杆菌 克雷伯菌属ESBL(+)ESBL(-)ESBL(+)ESBL(-)菌株数7117244106泰能100100100100美唑88929486西叮70838660他啶76959097吡肟89948897氨曲南9932190噻肟191089曲松293093,*数据来源于协和医院ddst method,000405,chmjampc,33,产ESBL大肠、克雷伯的敏感性*（%）,抗生素Eco.KpnESBL(+)ESBL(-)ESBL(+)ESBL(-)菌株数7117244106 阿米8594
15、8299舒普深19944295派拉035063特治星56897991特美叮7632083环丙20447586,*数据来源于协和医院,000405,chmjampc,34,ESBLs检测、判断和临床辨认,000405,chmjampc,35,ESBLs检测的原理和方法,ESBLs能水解三代头孢及氨曲南酶抑制剂能抑制ESBLsESBLs的检测方法双纸片法、三维试验法、肉汤稀释法、Vitek-AMS法、E-test法、抑制剂增强的纸片扩散法和肉汤稀释法,000405,chmjampc,36,Definition by NCCLS in 2001,Diminished zones,which shou
16、ld be suspected of harboring an ESBL,around:Ceftazidime22mm，Cefpodoxime22mm,Aztreonam27mmCefotaxime27mm，ceftriaxone25mmThese zone diameter should increase in the presence of clavulanic acid,000405,chmjampc,37,查K.Pneumoniae,K.oxytoca&E.coli菌中的ESBLs（初步筛选法),培养基：CAMHB抗生素浓度：琼脂内头孢泊肟 1ug/ml or头孢他啶 1ug/ml o
17、r氨曲南 1ug/ml or头孢噻肟 1ug/ml or头孢曲松 1ug/ml or使用2种以上的抗生素可以提高检测的敏感性,000405,chmjampc,38,第1级方法,000405,chmjampc,39,产ESBL大肠、克雷伯的敏感性*（%）进一步分析,双纸片协同法:圆心间距离：20mm25mm30mm,距20 30mm,CTX,Augmentin,000405,chmjampc,40,产ESBL大肠、克雷伯的敏感性*（%）进一步分析,纸片确证法CAZ，CAZ+ClavCTX，CTX+Clav,CTX,CTX+Clav,两圈差距=5mm 8 14,000405,chmjampc,41
18、,第2级方法,000405,chmjampc,42,产ESBL大肠、克雷伯的敏感性*（%）进一步分析,MIC 确证法加棒酸后MIC降低8倍,16/2 8,.12.25.5 1 2 4 8 16 32 ug/ml,不长,长,000405,chmjampc,43,E test法(头孢噻肟+克拉维酸 噻肟)1：8,头孢噻肟+克拉维酸 噻肟,MIC=0.5 MIC=4.0,000405,chmjampc,44,第3级方法,000405,chmjampc,45,鉴定大肠杆菌及肺炎克雷伯菌中的beta-内酰胺酶的流程 Sanders,AAC，1999，43(6):1393-1400,.MIC值(ug/ml
19、)产酶类型噻肟噻肟/棒酸曲松曲松/棒酸临床验证非ESBL22降8倍36/36 ESBL.20.5降8倍36/36 ESBL,000405,chmjampc,46,鉴定肠杆菌、枸橼酸杆菌中的beta-内酰胺酶的流程 Sanders,AAC，1999，43(6):1393-1400,.MIC值(ug/ml)临床验证产酶类型头孢曲松 曲松/棒酸其他B-内酰胺酶8降8倍15/16 ESBL,000405,chmjampc,47,ESBLs的辩认:耐药性特点,肠杆菌科细菌，尤其大肠,克雷伯菌对一个或多个三代头孢敏感性下降 常伴有氨基甙,喹诺酮协同耐药头孢呋新耐药酶抑制剂,头孢西丁部分有效亚胺培南敏感临床
20、治疗效果不好,000405,chmjampc,48,ESBLs的治疗对策(1),头孢菌素：(1)三代头孢菌素：CTX和CAZ耐药率高.(2)四代头孢菌素：耐药率不很高，对部分ESBLs（如CTX型）稳定。,000405,chmjampc,49,ESBLs的治疗对策(2),头霉素类和碳氢霉烯类：ESBLs虽然不能水解头霉素FX，但MIC90值为 256g/ml，耐药率为16%，可能是由于细菌外膜孔蛋白的缺失造成的。所有产ESBLs和非产ESBLs细菌对IP敏感，证实了碳氢霉烯类是目前对产ESBLs细菌最稳定的内酰胺抗菌药物。,000405,chmjampc,50,ESBLs的治疗对策(3),含酶
21、抑制剂的复合制剂：耐药率较低，分别为8%和2%，但中度敏感率较高，分别为 22%和28%，可能是这些细菌同时产生一定量的TEM-1和SHV-1而造成对复合制剂耐药程度的增加。在用复合制剂来治疗产ESBLs细菌感染时需适当增加剂量。近年来对酶抑制剂耐药的ESBLs的出现对复合制剂构成威胁，需开发新抑制剂。,000405,chmjampc,51,ESBLs的治疗对策(4),喹诺酮类和氨基糖甙类 产ESBLs细菌对AK的耐药率达42%，对CI的耐药率更高，达70%，说明这两类药物不适于产ESBLs菌株感染的治疗，除非有药敏资料证实是敏感的，且只能联合用药。,000405,chmjampc,52,ES
22、BL()菌株的治疗建议,加酶抑制剂的复合药：哌拉西林/三唑巴坦 头孢哌酮/舒巴坦 严重感染碳青霉烯类：美罗培南，亚胺培南头孢吡肟和头孢他啶体外显示敏感，国外证明头孢吡肟临床疗效和细菌清除率 80%，数据2003年NCCLS将修改。三代头孢菌素、头霉素类是不安全的，不适于产ESBL菌株感染的治疗；阿米卡星和环丙沙星不适于产ESBLs菌株感染的治疗，尤其是环丙沙星，除非体外药敏实验证明是敏感的,000405,chmjampc,53,ESBL的临床预后,高死亡率在一项儿童肿瘤患者的研究中，由产ESBLs细菌所致的感染引起或直接导致了15%的患者死亡。在一次医院内爆发流行，在可提供治疗及预后资料记录的
23、患者中的初步死亡率达53%高比例持续性定殖在一群已定殖产ESBL菌株数月的儿童肿瘤患者中，重新筛选检查发现其中60%患者持续出现无症状性细菌尿,000405,chmjampc,54,AmpC酶 由ampC基因编码产生，ampC基因表达同时受ampD，ampR，ampG等多种基因调控，是头孢菌素酶的代表酶，属于染色体Bush1型酶或Ambler C 类酶。常见的易产AmpC酶的细菌：阴沟肠杆菌，产气肠杆菌粘质沙雷菌 弗劳地枸橼酸杆菌,摩根摩根菌绿脓杆菌,什么是AmpC酶？,000405,chmjampc,55,AmpC酶水解以下抗生素：青霉素类 耐药头霉素类 耐药1,2,3代头孢菌素类 耐药单环
24、类 耐药加酶抑制剂复合药（克拉维酸，舒巴坦，他唑巴坦）耐药 可分为诱导型，结构型和质粒型。,什么是AmpC酶？,000405,chmjampc,56,头孢菌素酶诱导型,+,-,AmpR激活子,ampC激活 转录,AmpC,-lactamas,PBPs,AmpG感受器或跨膜转运,阻断细胞壁五肽交联桥（肽聚糖片断）,中间产物（配体）,AmpD循环利用,内膜,外膜,000405,chmjampc,57,+,-,AmpR激活子,ampC激活 转录,去阻遏持续高产或高度诱导型AmpC,-lactamas,PBPs,AmpG,阻断细胞壁五肽交联桥（肽聚糖片断）,中间产物,缺陷AmpD蛋白,内膜,外膜,调节
25、基因ampD突变,头孢菌素酶结构型,000405,chmjampc,58,5种抗生素对 60株 耐头孢他啶的肠杆菌属和枸橼酸杆菌属的活性,S%,000405,chmjampc,59,6种抗微生物药对109株肠杆菌属的活性,药名 敏感 耐药 MIC50 MIC90 亚胺培南 100 0 0.32 4头孢吡肟 89 6 0.38 12头孢哌酮/舒巴坦 69 16 2 96头孢他啶 64 28 2 512 头孢曲松 55 35 2 512 哌拉西林 51 46 16 512,Yingchun Xu,Minjun Chen etal.Diagn Microbiol Infect Dis 1999;35
26、:135-142,000405,chmjampc,60,14株阴沟肠杆菌耐药株对10种抗生素的MIC（g/ml）,菌株哌拉哌唑噻肟曲松他啶曲南 吡肟 亚培庆大 164163212812832 0.25 0.50.5 251264 256256128128 4 0.1250.5 512864 128128128644232 66432 646412864 0.5 0.1250.5 851264 256512256644 0.1250.5 1351264256256256644 0.1250.5 1425632 128256128642 0.1250.5 1825664 1281281286440
27、.250.25 1912816 64256128320.50.254 2012832 256256128322 0.1251 23512128 1282562566440.2532 24 12816 128 256 12864 0.50.250.25 2525664 1282561286420.250.25 27512128 25651225612840.250.25,ESBL AmpC,吴伟元，陈民钧等。中国临床药理学杂志，2001,70:104-109,000405,chmjampc,61,90的基因与阴沟肠杆菌的AmpC同源,肺炎克雷伯菌,质粒介导的MIR1酶,传播,水解：头孢西丁头孢他
28、啶头孢噻肟头孢曲松,1988年美国Papanicolaou质粒型AmpC酶,000405,chmjampc,62,000405,chmjampc,63,如何推测大肠杆菌和肺炎克雷伯菌产生质粒 AmpC 酶？,头孢西丁或头孢美唑R三代头孢菌素R/I/S加酶抑制剂类R/I/S头孢吡肟S碳青霉烯类S,000405,chmjampc,64,ESBL与AmpC 的差别,ESBL 高产AmpC 质粒AmpC SSBL 酶膜蛋白 碳青霉烯类SS S S R头孢吡肟S/I/RS S S/I/R R酶抑制复合药sR r R R三代头孢菌素R/I/s R R/I/s R R头霉菌素SR R R R主要 细菌：肺克
29、阴沟 肺克 大肠 嗜麦芽大肠枸橼酸 大肠 肺克 鲍曼 沙雷 沙门菌 绿脓绿脓,000405,chmjampc,65,肠杆菌属 沙雷菌属 枸橼酸菌属等的治疗建议,产诱导型AmpC酶：头孢吡肟,头孢哌酮-舒巴坦，哌拉-他唑巴坦,头孢他啶,碳青酶烯类,氟喹诺酮类产结构型AmpC酶：头孢吡肟，碳青酶烯类，氟喹诺酮类产ESBL：碳青霉烯类，哌酮-舒巴坦,哌拉-他唑巴坦,头孢吡肟（CTX-M）产SSBL：碳青酶烯类，头孢吡肟，氟喹诺酮类?,000405,chmjampc,66,PIP/TAZ综合分析,PIP/TAZ属-内酰胺/酶抑制剂复合类抗生素，在广谱、抗假单胞菌青霉素哌拉西林的结构中加上了酶抑制剂他唑
30、巴坦，对细菌产生的广谱和超广谱-内酰胺酶稳定。抗菌谱较广，可覆盖革兰阴性菌肠杆菌科、非发酵细菌、厌氧菌和粪肠球菌。,000405,chmjampc,67,PIP/TAZ综合分析,对革兰阴性菌总体及产生ESBLs的细菌（大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌）而言，PTZ的敏感率稍低于IMP，但优于AMK、CSL和第三代头孢菌素。对非发酵细菌中最主要的铜绿假单胞菌有很好的体外活性，甚至高于碳青霉烯类。用PIP/TAZ替代三代头孢，不引起肠道菌群失调（CD）和耐药菌株（VRE、MRSA、ESBLs等）定植。,000405,chmjampc,68,对三代头孢不敏感的细菌临床策略,G-ESBLs IMP，PTA，CSL，AMK，FOXAmpC IMP，FEP，AMKPAE PTA，AMK，CAZ，IMPABA IMP，CSLXMA SXT，TCC，CIPG+MRS VANC，TECVRE AMP，PTA+GEN，TEC,000405,chmjampc,69,谢谢！,
