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1、基因诊断（Gene Diagnosis）,20世纪40年代发现DNA是遗传物质以及50年代DNA的双螺旋结构被发现，进一步从本质上证实基因是决定人类一切生命现象的物质基础。,在第18届国际遗传学大会上，全世界3000名科学家对人类的生老病死做了新诠释“不论是器质性疾病还是功能性疾病，都有必要在基因水平上去探究病因”。除此之外，人类正常的发育、衰老和死亡，当然也受基因的调控。”,现在，人们已经从分子水平上认识到基因是一段能够编码一条到多条肽链氨基酸顺序的DNA。,传统的诊断,、问、望、听、触经验型判断的方法。、化验/检验细胞、组织、大分子、小分子、酶、代谢物；微生物、免疫学、生物化学、病理学等。
2、、影像学X线、B超、CT、核磁共振、内窥镜等。、特殊检查染色体检查、肌电/脑电/心电、骨密度、原子吸收光谱等。随着技术水平的发展，这些诊断方法也在不断的提高和完善，在医学实践中发挥了巨大的作用。并还将有更先进的方法问世。但这些方法大多存在一个无法克服的缺陷：不可预先诊断。,随着分子生物学和分子遗传学的发展，越来越多的证据表明，绝大多数疾病的发生和发展都与患者的遗传物质结构和功能改变有关，所以遗传物质的检查越来越显得必要。,基因诊断的定义 应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构和功能变化而作出的或辅助临床诊断的技术，称为基因诊断。,基因诊断具有灵敏度高、特异性强、费用低，并对许多疾病特别是
3、遗传性疾病做出预先诊断的优点。它是一种极具发展潜力的诊断方法。,由于基因诊断发展的时间不长，人们对于基因，特别是致病基因的了解还有许多空白，因此许多疾病的诊断还主要依靠其他方法。此外，基因诊断的发展并非取代和抛弃其他方法，而是相互补充，共同发展。,长期以来，单基因遗传病的诊断主要靠临床观察和一系列生化检查，但生化学检查要求有相应基因表达产物的体液或细胞，并对基因产物或代谢异常机理有所了解。但对绝大多数遗传病而言，目前还远未达到这种认识。理想的诊断方法是对患者基因或DNA本身直接进行分析，因为这种分析摆脱了上述各种限制。机体各种组织的核细胞均有全套基因组DNA，可以作为分析的材料，而不必考虑表达
4、问题，是目前诊断技术中最具发展前途的技术。,诊断方法的变更,基因诊断的对象,1.病原生物的侵入，如肝炎、艾滋病、支原体、细菌、寄生虫。2.先天遗传性疾患，如苯丙酮尿症、无丙种球蛋白血症。3.后天基因突变引起的疾病，如肿瘤。4.其它，如亲子鉴定、个体识别、法医物证。,与疾病相关的遗传物质改变主要有两类，1.遗传物质，即DNA或RNA的水平的变化。如病毒感染时病毒基因及其转录产物在人体内的从无到有，某些肿瘤中癌基因表达水平的从低到高。2.遗传物质的结构变化，即基因突变。如点突变引起的基因失活、染色体转位引起的基因激活或灭活等等。因此，从理论上说，所有涉及基因结构和功能变化的检测都属于基因诊断。,基
5、因诊断的内容,常用基因诊断的技术,1.Hybridization2.PCR3.RFLP4.AFLP5.ASO6.SSCP,每个人的DNA是不完全相同的，一般每100500bp就有一个是不相同的，即多态性。在两套基因组DNA中平均有1000万处不同，它们多位于内含子序列中。碱基的变异就可能导致酶切点的消失或新的切点出现，当使用同一限制酶切割不同个体基因组DNA时，DNA片段长度出现差异，这种由于内切酶切点变化所导致的DNA片段长度的差异，称为限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism,RFLP）。RFLP反映了常见的个体间DNA核苷酸的
6、可遗传性变异，它按照孟德尔方式遗传。RFLP可用Southern印迹杂交法检出。,1.RFLP(restriction fragment length polymorphism),等位基因2由于出现新的切点，DNA片段缩至8kb。,DNA片段电泳后杂交图,RFLP的检出等位基因1因有额外切点而导致产生两个长短不同的DNA片段（3kb及5kb）且均能与探针杂交。,在人类基因组中还存在一类DNA重复序列，称为小卫星DNA。它们分布十分广泛，每个重复单位通常只有几几十个碱基对，但其重复次数在人群中是高度变异的，又叫数目变异的串联重复（variable number tandem repeats,VN
7、TR）。当用限制酶切割VNTR区时，只要酶切点不在重复区内，就可能得到各种长度不同的片段，可用于致病基因的连锁分析。,串联重复的短片段的长度多态性可以通过PCR扩增后电泳来检出，并用于致病基因的连锁分析，这种诊断方法称为扩增片段长度多态性（AFLP）连锁分析法。PCR扩增后，产物即等位片段之间的差别有时只有几个核苷酸，故需用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离鉴定。此法多用于突变性质不明的连锁分析。,2.AFLP（amplified fragment length polymorphism）,当基因的突变部位和性质已完全明了时，可以合成等位基因特异的寡核苷酸探针（allele-specific oligon
8、ucleotide，ASO）用同位素或非同位素标记进行诊断。探针通常为长20bp左右的核苷酸。用于探测点突变时需要合成两种或两种以上的探针，一种与正常基因序列完全一致，能与之稳定地杂交，但不能与突变基因序列杂交；另一种与突变基因序列一致，能与突变基因序列稳定杂交，但不能与正常基因序列稳定杂交，这样，就可以把只有一个碱基发生了突变的基因区别开来.PCR可结合ASO，即PCRASO技术，即先将含有突变点的基因有关片段进行体外扩增，然后再与ASO探针作点杂交，这样大大简化了方法，节约了时间，而且只要极少量的基因组DNA就可进行。,3.ASO（allele-specific oligonucleoti
9、de）,等位基因特异的寡核苷酸探针(ASO)检测点突变,基因诊断的临床检测应用,1.基因诊断在感染性疾病检测中的应用,乙型肝炎病毒（HBV）、人乳头瘤病毒（HPV）：其DNA可以使用点杂交、PCR方法直接检出。丙型肝炎病毒（HCV）、人免疫缺陷病毒（HIV）：其RNA可以使用RT-PCR方法直接检出。,结核杆菌和疟原虫的分型可以使用探针杂交和PCR方法检出。,丙型肝炎(HCV)基因诊断实例,丙型肝炎为RNA病毒，9500mer，编码3011-3033个氨基酸，具有高变异性。基因组组成：,E1,NS2,NS3,NS4,3-NCR,C,NS1/E2,NS1,5-NCR,高变异区（编码衣壳和包膜蛋白
10、）,NCR:非编码区,5-NCR为保守的区域，将引物设计在该区域，进行RT-PCR,可特异性的扩增HCV。,PCR引物：+:5-GATTCTCGAGGCGACACTCCACCATAGAT-:5-ATACTCGAGGTGCACGGTCTACGAGACCT,PCR产物长度为322bp,2.基因诊断在遗传病检测中的应用,镰状细胞贫血症（globin，6），其GAGGTG的突变，可用RFLP（Mst II，CCTNAGG）或PCR-SSCP检出。,甲型血友病（FVIII，XR）可用PCR-RFLP检出。,142 bp 99 bp,3.基因诊断在肿瘤检测中的应用,在许多肿瘤中存在的癌基因 ras、myc等的突变抗癌基因P53、Rb等的突变、丢失可用PCR、PCR-ASO、PCR-SSCP等方法检出。,4.基因诊断在个体识别中的应用,鉴定基因多态性的方法均可用于：亲子鉴定、个体识别、法医物证,
