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1、,第二章 固相萃取,学习要点,固相萃取的操作步骤,固相萃取的装置,一、概述,所谓萃取法,就是从样品中提取组分,传统的方法是液-液萃取法(LLE),即用液体作为提取剂。固相萃取（Solid Phase Extraction,SPE）是19世纪70年代后期发展起来的样品前处理技术。它发展迅速，广泛应用于环境、制药、临床医学、食品等领域。,一、概述,与液液萃取相比，固相萃取具有如下优点：回收率和富集倍数高有机溶剂消耗量低，可减少对环境的污染采用高效、高选择性的吸附剂，能更有效的将分析物与干扰组分分离无相分离操作过程，容易收集分析物能处理小体积试样操作简便、快速，费用低，易于实现自动化及与其他分析仪器
2、连用。,一、概述 样品类型,SPE可以用于所有类型样品的处理，但是液体样品是最容易处理的。,Survey response%,固相萃取（SPE）是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱，达到分离和和富集的目的。,二、基本原理、分离模式及操作步骤,1、基本原理,样品在两相之间的分配，即在固相（吸附剂）和液相（溶剂）之间的分配。固相萃取保留或洗脱的机制取决于被分析物与吸附剂表面的活性基团，以及被分析物与液相之间的分子作用力。洗脱模式有两种：一种是目标化合物比干扰物与吸附剂之间的亲和力更强，因而被保留，洗脱时采用对目标化合物亲和力更强的溶剂；另一
3、种是干扰物比目标化合物与吸附剂之间的亲和力更强，则目标化合物被直接的洗脱。通常采用前一种洗脱方式。,2.固相萃取的分离模式,反相固相萃取正相固相萃取离子交换萃取,有机溶剂非极性顺序,正己烷环己烷四氯化碳甲苯苯无水乙醚氯仿二氯甲烷四氢呋喃乙酸乙酯丙酮乙腈异丙醇甲醇水乙酸,反相固相萃取,反相：吸附剂（固定相）是非极性或弱极性的，如硅胶键合C18,C8,C4，C2,-苯基等。流动相为极性（水溶液）或中等极性样品基质。吸附剂的极性小于洗脱液的极性。应用：可以从强极性的溶剂中（如水样）萃取是非极性或弱极性的化合物。作用机理：非极性-非极性相互作用，如范德华力或色散力。,正相固相萃取,吸附剂：极性键合相，
4、如硅胶键合NH2、CN，-Diol（二醇基）；极性吸附剂，如silica、florisil、(A-,N-,B-)alumina、硅藻土等。流动相为中等极性到非极性样品基质。作用机理：1）极性-极性相互作用2）表面硅羟基、铝羟基与极性化合物的极性官 能团之间相互作用，包括氢键，-键等。3）偶极-偶极相互作用4）偶极-诱导偶极相互作用应用：从非极性溶剂样品中萃取极性化合物,硅胶柱(silica),表面SiOH,中等强度的吸附剂，适用于从非极性基体中吸附极性化合物。硅胶是一种酸性吸附剂，可以吸附酸性（有机酸类）或中性的极性化合物，由于表面的硅醇基可以释放出弱酸性的氢离子，又作为一种弱酸性阳离子交换剂
5、，吸附碱性化合物（生物碱类，胺类）。活性（吸附性）与硅胶的含水量有关，根据其中含水量不同分为不同的活性等级。硅胶的活化：加热到100-110度，除去表面吸附的水份，当温度升到500度，表面的硅醇基脱水变成硅氧烷键，从而丧失吸附性。硅胶极亲水：分析的样品溶液必须无水。备注：硅胶净化时，一般杂质保留在柱上，目标化合 物流出。,正相萃取或反相萃取选择原则,总目的：杂质和待分析物分离1、受样品基体提取溶剂，要分离的杂质和目标化合物的性质制约a)物质在柱上的保留（或洗脱）取决于其与吸附剂和样品基体溶剂（或洗脱溶剂）之间亲和力的相对大小。样品基体是强非极性溶剂，如正己烷，二氯甲烷等，一般要选用正相柱分离。
6、样品基体是强极性溶剂，如水和甲醇，乙腈及丙酮的混合液，要选用反相柱分离。,离子交换固相萃取,离子交换固相萃取用于萃取分离带有电荷的分析物固定相为带电荷的离子交换树脂，流动相为中等极性到非极性样品基质。分析物与吸附剂间的作用是静电吸引力。离子交换固相萃取分为阴离子交换固相萃取和阳离子交换固相萃取。,三、固相萃取的操作步骤,一个完整的固相萃取步骤包括固相萃取柱的预处理、上样、洗去干扰物质、洗脱及收集分析物四个步骤。,一是为了润湿和活化固相萃取填料，二是为了除去填料中可能存在的杂质，减少污染。采取的方法是用一定量溶剂冲洗萃取柱。反相类型的固相萃取硅胶和非极性吸附剂介质，通常用水溶性有机溶剂如甲醇预处
7、理，然后用水或缓冲溶液替换滞留在柱中的甲醇。正相类型的固相萃取硅胶和极性吸附剂介质，通常用样品所在的有机溶剂来预处理。离子交换填料一般用35mL 去离子水或低浓度的离子缓冲溶液来预处理。固相萃取填料从预处理到样品加人都应保持湿润，如果在样品加入之前，萃取柱中的填料干了，需要重复预处理过程。,a.固相萃取柱的预处理,b.上样,将样品倒入活化后的SPE 小柱，然后利用加压、抽真空或离心的方法使样品进入吸附剂。采取手动或泵以正压推动或负压抽吸方式，使液体样品以适当流速通过固相萃取柱，此时，样品中的目标萃取物被吸附在固相萃取柱填料上。,b.上样,目的是为了除去吸附在固相萃取柱上的少量基体干扰组分。一般
8、选择中等强度的混合溶剂，尽可能除去基体中的干扰组分，又不会导致目标萃取物流失。反相萃取体系常选用一定比例组成的有机溶剂-水混合液，有机溶剂比例应大于样品溶液而小于洗脱剂溶液。,c.洗去干扰物质,d.洗脱及收集分析物,选择适当的洗脱溶剂洗脱被分析物，收集洗脱液，挥干溶剂以备后用或直接进行在线分析。为了尽可能将分析物洗脱，使比分析物吸附更强的杂质留在SPE 柱上，需要选择强度合适的洗脱溶剂。,四、固相萃取基本装置,基本装置包括固相萃取柱、固相萃取过滤装置。,（1）固相萃取柱,商品化的固相萃取柱（cartridge）外形类似于一个注射器针筒。还可自行填装固相萃取柱。,（2）固相萃取过滤装置,固相萃取
9、加样过程中，需通过适当的方法使样品溶液通过固相萃取柱，使待分析物吸附在填料上。洗脱过程中，同样需要使溶剂通过固相萃取住，使待分析物解析。以上步骤需借助于固相萃取过滤装置完成，采用柱前加压或柱后加负压抽吸的方式实现。,a.固相萃取过滤-加压操作,固相萃取加压操作可通过在液体样品储液槽上方用高压空气或氮气施加一定压力来实现的。如果样品较少，可以用手动加压的方式实现。,美国Supelco公司提供的给单个固相萃取小柱加压的单管处理塞。,b.固相萃取过滤-负压抽吸,负压抽吸是在固相萃取柱的出口用注射器手动抽负压，或与水泵或真空泵相连，用泵施加适当真空度，从而使样品溶液抽吸通过固相萃取柱。最常用的是用抽滤
10、瓶实现负压抽吸。,也可以采用固相萃取过滤装置同时处理多个样品,c.固相萃取过滤-离心法,全自动固相萃取仪,全自动固相萃取仪能自动完成固相萃取的全部步骤,固相萃取联用装置,四、固相萃取方法的建立及应用,固相萃取吸附剂的选择固相萃取溶剂的选择固相萃取的应用,1.固相萃取吸附剂的选择-固相萃取吸附剂的要求,固相萃取吸附剂最好为多孔的、具有大的表面积的固体颗粒。固相萃取吸附剂应有较低的空白值。萃取吸附过程必须可逆且有高的回收率。固相萃取吸附剂要有高的化学稳定性。固相萃取吸附剂必须与样品溶液有好的界面接触。,键和硅胶吸附剂石墨碳离子交换树脂金属配合物吸附剂聚合物吸附剂免疫亲和吸附剂分子嵌入聚合物,1.固
11、相萃取吸附剂的选择-常用固相萃取吸附剂,键和硅胶吸附剂,常用的键合硅胶吸附剂表面积在50500m2/g 之间，孔径为550nm，粒径大于40m。一般应选择粒径小、比表面积大的吸附剂，以获得更好的萃取效果。但要注意若粒径过细，萃取时阻力增加，萃取速度下降。,1.固相萃取吸附剂的选择,应根据分析对象、检测手段及实验室条件合理选择。,2.固相萃取溶剂的选择,在固相萃取固定相活化、上样富集、淋洗杂质、分析物洗脱过程中，都涉及到溶剂选择问题。,a.固定相活化溶剂的选择,一般使用两种活化溶剂。第一种溶剂（初始溶剂）用于净化固定相，对于常用的C18键和硅胶固定相，可用甲醇有效地除去其所含杂质。第二种溶剂（终
12、溶剂）使固定相溶剂化，以便样品中的分析物能更好的保留。,b.上样萃取溶剂的选择,为了使分析物更好地保留在固相萃取柱上，上样萃取时应采用尽可能弱得溶剂。,c.淋洗溶剂的选择,淋洗溶剂用于洗去吸附在固定相上的干扰组分。淋洗溶剂的强度选择非常重要，其强度不能太高，也不能太低，应大于或等于上样溶剂，又小于洗脱溶剂。淋洗溶剂的选择原则：尽可能将干扰组分从固定相上洗脱完全，但又不能洗脱任何分析物。,溶剂强度应足够大，以保证吸附在固定相上的分析物定量洗脱下来。选择的洗脱溶剂应与后续的分析相适应。选择粘度小、纯度高、毒性小并与分析物和固定相不发生反应的溶剂。选择单一溶剂效果不理想时，可以考虑使用混合溶剂进行洗
13、脱。,d.洗脱溶剂的选择,3.固相萃取的应用,固相萃取在环境分析的应用-多环芳烃、农药残留等有机污染物的检测。固相萃取在生物样品分析中的应用-生物检材中毒物和药物残留分析、血液中药物分析和药物动力学研究。固相萃取在食品分析中的应用,1）固相萃取测定生物检材中安眠酮（导数紫外）2）双柱富集固相萃取测定钯、锶（FAAS）3）固相萃取富集水中多环芳烃（HPLC)4）固相微萃取富集多环芳烃GC-MS,柱色谱实验,柱层析法：是分离，纯化和鉴定有机化 合物的重要方法之一。基本原理：利用混合物各组分在某一物质中的吸附或溶解性能（即分配）的不同，或其它亲和作用性能的差异，混合物的溶液流经该种物质，进行反复的吸
14、附或分配等作用，从而将各组分分开。,当加入的洗脱剂流下时，由于不同化合物吸附能力不同，因而以不同的速度沿柱向下流动，继续洗脱时，吸附能力弱的组分随溶剂首先流出。在连续洗脱过程中，不同组分或不同，色带就能分别收集，从而达到分离纯化的目的。,1、吸附剂常用的吸附剂：氧化铝，硅胶，氧化镁，碳酸钙，活性炭或纤维素粉。选择吸附剂的首要条件：不与被分离物或展开剂发生化学反应。吸附能力与以下几点有关：（1）吸附剂颗粒大小（2）吸附剂含水量,2 溶剂通常根据被分离物中各组分的极性、溶解度和吸附活性等来考虑。先将带分离的样品溶于尽量少的非极性溶剂中，从柱顶流入柱中，依次增大溶剂的极性，将不同化合物依次洗脱。,常
15、用洗脱剂的极性：石油醚 环己烷 四氯化碳 甲苯 苯 二氯甲烷 氯仿 乙醚 乙酸乙酯 丙酮 乙醇甲醇水 乙酸,三、实验步骤及注意事项,1、在玻璃色谱柱(d=1cm,l=10cm)底部用脱脂棉轻轻塞紧,称取 4g 硅胶于小烧杯中,加入 15mL蒸馏水,用玻璃棒调好。2、在柱中先加入1/2 柱高的蒸馏水,打开活塞,在搅动下把糊状硅胶加入柱中,同时调整活塞使流速为1滴/s。,3、当柱中液面将要露出硅胶面时,加入 5mL左右的A 液,当硅胶面又将要露出时,关紧活塞,用移液管准确加入 0.50mL以A液做溶剂的混合液(含甲基橙和亚甲基蓝各为0.400gL-1)。H2O95%乙醇=11(A 液)0.2mol
16、 L-1HCl 95%乙醇=11(B 液)。,4、待此混合液将要渗入柱内时，立即用 A 液洗脱，此时可以观察到有鲜明的黄、蓝两条色带形成。黄色的甲基橙色带随洗脱剂的加入不断下移，而其顶部蓝色带不移动，当黄色带到达柱底部时，更换接受器，全部收集此黄色带，洗脱时间约 10 min。5、此后改用B 液做洗脱剂，这时可看到蓝色带开始下移，当亚甲基蓝色带到达底部时，更换接受器，全部收集此蓝色带，洗脱时间约 30 min。,【洗脱时切勿使溶剂流干！】使用过的吸附剂倒入垃圾桶里，切勿倒入水槽，以免堵塞水槽,习题,固相萃取包括哪几个步骤？柱色谱（柱层析）实验过程中的注意事项有哪些？正相型和反相型固相萃取中常用溶剂的极性大小（P32）,
