现代生物技术.ppt.ppt
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1、现代生物技术在水产养殖中的应用,现代生物技术:,运用现代生物科学、工程学和其它基础学科的知识,按预先的设计,对生物进行控制和改造,或模拟生物及其功能,用来发展商业性加工、产品生产和社会服务的新兴技术领域.,现代生物技术的主要领域,生物控制和改造技术:基因工程细胞工程发酵工程酶工程蛋白质工程生物模拟技术:生物机体和功能模拟技术(人工智能)人工生物系统技术(人工视网膜,肝支持系),生物技术应用的目的,生物技术是以生命科学研究成就为基础的综合性技术,是从微观上认识和控制生物的遗传物质和遗传过程,了解生命的全貌,其目的是要解决人类社会中的人口、粮食、肉蛋奶、环境能源医疗等各种具体问题。,生物技术在水产
2、养殖业的应用,种质资源的发掘和保存遗传育种和品种改良健康养殖与食品安全,水产养殖业现状,能够大量生产苗种的种类还不够多,可大量生产苗种的种类生产还不够稳定,苗种还不够健壮,抗病性差;同一养殖种类,不同海区单产高低悬殊;有些养殖种类种质退化;多种养殖生物的病害频发,缺乏有效的防治措施;食品安全与健康养殖,水产养殖业面临许多重大的技术难关,1、养殖品种近亲繁殖,种质退化,育苗和养成技术比较落后。养殖生态研究不深入,集约化高产技术多未形成。2、养殖病害爆发、流行日趋严重。继虾病流行后,鱼类、贝类也发生了大面积发病。3、缺少优良品种(高产抗逆)和高产值养殖对象(鱼、虾、鲍鱼等)。4、养殖种营养研究和高
3、效人工饵料配置尚不能满足生产需要。,细胞工程与染色体工程,1、组织培育及细胞工程育苗研究,鱼、虾、贝类三倍体育种技术的研究,生物基因工程育种研究;2、水产动物雌核发育和性别控制研究。建立了大型海藻良种克隆纯培养及保存技术、海藻生物反应器育苗技术、对虾、牡蛎、扇贝、珠母贝等的多倍体诱导培育技术及对虾性控技术、全雌牙鲆种苗培育、名贵的石斑鱼性控研究方面也取得重要进展。,多倍体育种技术和雌核发育技术,是在染色体水平上操作,进行品种的改良。人工诱导的主要目的在于利用三倍体,三倍体具有生长快、净肉率高、肉质好,生命周期长等特点;另外三倍体还有利于种群控制,具有较高的抗病力和抗逆性。,雌核发育,诱发雌核发
4、育除了可以加快建立纯系和控制性别外,还可以使一些稀有的隐性等位基因显现而产生优良性状,使具有重要经济性状的显性基因转为纯合状态,雌核发育后代还可用来鉴定鱼类的近交衰退现象等。,雌核发育的应用,雌核发育的遗传基础均来自母本,其后裔具有很高的纯合性。一次人工雌核发育的纯度相当于连续四代的兄妹近交,人工雌核发育二代相当于连续八代的近交。因此,任何鱼类只需经过一次雌核发育,其子代再经过一次雌核发育,就可以作为纯系亲本用于育种生产。在杂交育种时,由于杂种后代不断分离,要获得一个稳定的品种需要很长的时间。如果利用杂交子一代或杂种子二代的卵子进行雌核发育,只需二代或三代就可以获得纯系,使性状一致并保持稳定。
5、雌核发育的后代全为雌性,可以控制单性养殖。此外,雌核发育可以提高产量,目前国内最能说明雌核发育作用的就是雌核发育的异育银鲫生长速度比母本方正银鲫平均快34.7,比当地鲫快2-3倍。,异育银鲫,异育银鲫采用方正银鲫作母本,兴国红鲤作父本,进行人工授精后雌核发育子代,因是异精雌核发育故将其子代简称为异育银鲫。这是中国科学院水生生物研究所于1981年研究成功的养殖新品种。,建鲤,建鲤是我国养殖鱼类杂交选育的第一个品种,中国水产科学研究院淡水渔业研究中心通过杂交,定向选育;利用雌核发育等综合育种技术育成遗传性状稳定的鲤鱼优良新品种,定名为建鲤,其基本方法是首先选择配合力高,性状又能互补的纯种荷包红鲤,
6、原江鲤分别作母本、父本的杂交组合后代作为育种的基础种群,让雌、雄亲鱼交配繁殖形成一个家系,对其后代进行隔离养殖,并连续高度近亲交配。在选择强度高、选择指标严格一致情况下,从各家系选留极少数量最优个体,到子四代进行家系间杂交,此时遗传的稳定性、一致性可达80以上,最后让子四代与两个原始亲本相同、选择指标一致的雌核发育相结合,其子代(第三代、六代)遗传性状的稳定性和一致性达到98以上。,性别控制,种间杂交:我国以性别控制为目的非鲫种间杂交,主要是尼罗非鲫雌鱼与奥里亚非鲫雄鱼的杂交,即奥尼鱼quanxiong。诱导性反转:用性激素诱导法获得的性反转鱼,包括雌转雄,我国这方面实验的主要对象是莫桑比克非
7、鲫和尼罗非鲫等,均获得了性转化鱼。超雄鱼生产技术:中国水产科学院长江水产研究所于1980年提出并实现了罗非鱼人工转性三系配套的方案。以雌鱼激素(苯甲酸雌二醇)诱导莫桑比克罗非鱼使其性转化为功能上的雌鱼,再与正常的雄鱼交配,获得部分超雄鱼。筛选出这种超雄鱼与正常的莫桑比克罗非鱼交配,即可获得全雄后代。此法能够大批量地进行全雄鱼生产,省去了对逐批鱼种使用激素处理的麻烦和成本消耗,但增加鱼种体内激素,不符合标准化生产良种的要求。因此,养殖户只需从制种单位购买超雄鱼与天然雌鱼,交配就能得到遗传上的全雄单性鱼,从而大大提高生产无公害商品鱼质量。自身免疫阉割:用某种鱼的精卵巢组织液作抗原物质,注射到同种异
8、体幼鱼体内,使幼体内产生抗体,抑制其性腺发育,产生自身免疫阉割现象,从而产生中性不育鱼。这一技术已在鲑鳟鱼类和鲤鱼的试验中获得成功。外科手术阉割用外科手术摘除性腺,可产生中性不育鱼,并诱导产生性逆转。有人将150尾雌性博鱼(Bettasplendens)的卵巢割去,三个月后,有7尾已从残留的输卵管壁完全形成了能发挥功能的精巢。这种性逆转的雄鱼也是生理型雄鱼。由于这种方法操作不便,因而很难在生产上实际使用。,鱼类性别控制育种的价值,(1)提高群体生长率(2)控制繁殖速度(3)延长有效生长期,细胞核移植,细胞核移植技术是将一细胞核移植到另一去核的未受精卵或细胞内的生物技术。我国著名生物学家童第周等
9、率先进行同种鱼的细胞核移植,随后在这两种鱼间进行了不同亚科之间的细胞核移植,获得了多种移植的核质杂交鱼。林礼堂等(1996)把鲫鱼、鲮鱼和尼罗罗非鱼的体细胞核移植到鲤鱼的成熟去核卵中获得了不同发育阶段的胚胎和幼鱼。目前,我国在鱼类细胞核移植技术的理论研究和实际应用方面都居世界领先地位。,细胞核移植的作用,细胞核移植又称细胞工程核质杂交。它通过显微手术将成为供体的一种动物的一个细胞核,移植人称为受体的同种或异种的另一个细胞质中,并使受体细胞得以继续分裂和发育的方法。此技术除用于研究胚胎发育种的核质关系、功能、及其发育机理等方面的一些基础讨论问题外,自20世纪70年代起又应用这种方法来探索经济鱼类
10、的育种途径。由于核质杂交、移核杂交的鱼后代能保持性状的稳定,其性状有的移核鱼介于亲本之间,有的偏于受体特性,有的能够成熟并繁殖后代,因而为解决鱼类远缘杂交不育,培育具有稳定性状的优良品种开辟了新途径。,细胞培养技术,这项技术已广泛应用于鱼类细胞、珍珠贝外套膜上皮细胞以及海藻细胞等的培养。水产动物细胞培养起始于鱼类,同时以鱼类细胞培养研究开展得较为系统,已建立的鱼类细胞系也较多。,细胞培养技术(组织培养),从动物或植物内取出器官、组织或经处理分散的细胞,置于一种模拟生物体内环境的人工培养基中培养,使其在离体的情况下,生存、生长、发育乃至繁殖。细胞培养包括单个细胞培养、组织培养和器官培养。植物的细
11、胞具有发育的全能性。应用:单倍体育种。动物的细胞虽然具有遗传的全能性,但除卵细胞外,都不具有发育的全能性,只有卵细胞具有发育成完整个体的能力。,动物细胞培养,是动物细胞工程的一项基本技术,是动物细胞融合、细胞核移植和基因工程的基础。,细胞融合技术(细胞杂交技术),细胞融合技术,是通过人工诱导,把两种或两种以上遗传性不同的生物细胞融合在一起,从而获得兼备两个亲本遗传性状的杂交细胞的技术。1、细胞融合育种。2、研制单克隆抗体。,转基因技术,根据人们的需要,把有用的外源目的基因,如生长激素基因、抗冻基因、抗病基因等及其调控序列一起,导人受体的胚胎或受精卵中并使之表达,从而达到遗传改良的目的。基因转移
12、作为生物遗传改良、培育快速生长和抗逆优良品种的有效技术手段,已成为应用技术研究发展的重点。,转基因技术的应用,转基因技术可有效应用在:(1)提高鱼鱼的生长率(2)控制生殖细胞的形成、不孕和性别的变异等(3)增加对疾病抵抗力,提高存活率(4)适应极端的环境,如对寒冷的抵抗力(5)改变生物化学特性以加强营养价值或肉质口感(6)改变新陈代谢的途径以增加饲料利用性。,转基因技术在渔业品种改良上的应用,转基因在水产养殖品种改良上的应用,目前多著眼于可提高生长速率及抗逆境基因的转移生长激素(growth hormone)基因的转移抗冻蛋白(antifreeze protein,AFP)基因的转移,大致等效
13、原则(substantial equivalence principle),基因转移应用在水产养殖品种改良上的最终目的是增加人类食品的供应,因此不能忽略生物技术食品的安全性评估。欧盟提出的大致等效原则(substantial equivalence principle)已普遍被大众接受基于此原则,全鱼(all-fish)基因转移是发展转基因鱼的趋势(其它水产养殖品种也类推)。,全鱼(all-fish)基因转移,全鱼基因转移是指所有欲转移的基因及所使用各项调控因子均取自鱼类(尽量是同种或近似种),因此成功的转基因鱼类只是改变了部份基因的调控所表现出的优质性状,不带有任何其它生物的基因片段,如此就
14、能符合大致等效原则的第一级安全性。,遗传及生态安全性,生产无生殖能力的转基因鱼鱼可将其对生态的影响降至最低。以多倍体操作技术生产无生殖能力子代的技术,或可应用在转基因鱼的育种方面。由于转基因鱼对与自然界中经过长时间演化筛选出的鱼种的影响仍有许多未知之处,因此相关的应用需格外慎重。,基因转移在水产养殖品种改良上的具体应用,加速生长的品种改良抗逆境的品种改良 抗病害的品种改良 改变代谢途径以增进对饲料的吸收转换效率,加速生长的品种改良,水产养殖的成本中,饲料占大部分,所以培育生长快速的转基因鱼的目的除了希望加快生长外,也期望降低饲料系数以大幅降低成本。生长素基因转移鲑鱼体型通常是一般鲑鱼的3-5倍
15、大。在生长阶段的早期,有些转基因个体的体型甚至是同期正常鲑鱼的10-30倍。在一些体型较大的转基因鱼身上会有一些如末端肥大的畸形情况,但是中等体型的转基因鱼并不会有类似情况出现,而且具有高繁殖能力,可以继续生产出下一代的转基因鱼。,抗逆境的品种改良,培育抗冻转基因鱼是抗逆境之品种改良最佳代表。许多冷水域海水鱼生存于冰封的环境之中,为了避免冻结,数种鱼种可产生一群独特的蛋白质抗冻蛋白质AFPs或抗冻糖蛋白质(antifreeze glycoproteins,AFGPs),它们可与冰晶作用,并有效地降低冰冻温度。,抗病害的品种改良,虽然目前仍未有转移成功的抗病毒或抗细菌性疾病的转基因鱼,但生产抗病
16、转基因鱼品种的策略有多种选择,例如转移下列任一DNA都可能使转基因品种增加抗病能力(1)可转录出反义RNA(antisense RNA)的DNA(2)可转录出核酶(ribozyme)的DNA(3)抗病毐基因(4)抗微生物(antimicrobial)基因(5)宿主免疫防御反应相关的基因等,改变代谢途经以增进对饲料的吸收转换效率,某些养殖鱼类由于遗传特性的差异,缺少一些生化代谢过程中的某些酶,而造成其碳水化合物的利用率以及食物转化率偏低,换言之养殖鱼类需要更多的饲料喂养才能达到理想的生长状态。利用基因转移的方法,使这些鱼类也具有原來缺少的酶,将可用更少的饲料以及更短的饲养时间来达到预期的成长以获
17、得最佳产量。,分子标记技术,分子遗传标记是指利用分子生物学方法来区分不同的个体或群体能够稳定遗传的物质或性状,是生物个体或群体间遗传差异的客观表征。目前限制性片段长度多态性(RFLP),简单序列长度多样性(sSLP),随机扩增多态性DNA(RAPD),单核苷酸的多态性(SNP)是最流行的分子标记技术。,分子标记的应用,分子标记一个重要的应用就是来构建遗传图谱。遗传图谱的建立为基因定位,特别是一些重要经济性状和数量性状位点的定位,并为最终克隆这些基因提供了基础,同时还可以推动生物的分子标记辅助选育和遗传改良。,分子标记的应用,分子辅助育种已成为有效的育种工具,它是根据与某一性状或基因紧密连锁的标
18、记的出现来推断该基因或性状的有无,从而进行选育的方法,可以增加选择的准确性,大大缩短育种的周期。进而大幅度提高养殖生产中优质原良种的普及率,达到增产增效的目的。,分子标记技术与遗传多样性,研究了将鱼类基因内含子作为遗传多样性评价指标的可行性.利用寄生性原生动物和有毒甲藻基因组DNA的间隔区序列作标记检测环境水体中这些病原生物的污染程度.应用18S和5.8 S核糖体RNA基因之间的第一个内部间隔区(ITC1)序列作标记进行甲壳类生物种间和种内遗传多样性研究;研究了斑节对虾三个种群的线粒体DNA多态性,用PCR技术鉴定了夏威夷Gobioid苗的种类特异性。采用同功酶、微卫星DNA及RAPD标记对褐
19、鳟不同种群的遗传变异进行了评价,在鲆鱼鉴定并分离出12种微卫星DNA,在美国加州鱿鱼上发现了高度可变的微卫星DNA;弄清了一种深水鱼类(Gonostoma gracile)线粒体基因组的结构,并发现了硬骨鱼类 tRNA基因重组的首个实例,测定了具有重要商业价值的海水轮虫的卫星DNA序列,用AFLP方法分析了母性遗传物质在雌核发育条纹鲈基因组中的贡献。,基因图谱(genetic map)的构建与品种改良,水产养殖动物经常靠遗传选种来改良品种,因此需要基因标记来追踪及了解各株系及其特征间的关系。水产动物如鲶鱼、鳟鱼、白虾(Penaeus vannamei)、草虾(P.monodon)、斑节虾(P.
20、japonicus)、牡蛎等的基因图谱已构建。,虾的基因图谱构建,虾的基因组相当大(约为人类基因组的70%左右)且具高重复性(repetitive nature),不同虾种在基因组重复区(repetitive region)缺乏序列保守性(sequence conservation)。某一种虾所找到的微卫星标记(microsatellite markers)无法适应于另一种虾,因此扩增片段长度多态性(Amplified fragment length polymorphism,AFLP)定位法也常做为分辨虾群的工具。虾种间缺乏合适的标记会阻碍图谱对比的研究发展。建立草虾分子图谱(molecul
21、ar map)国际性合作计划,正建立草虾基因组扩增片段长度多态及微卫星标记。计划构建草虾遗传性抗病毒力(heritable resistance to viral disease)以及生长等特征的连锁图谱,以期养殖户能利用标记选种工具(marker-assisted selection tool)筛选出优质种虾(high-performing broodstock)。,EST(expressed sequence tag)计划,在EST计划方面,由草虾的消化组织、泳足及眼柄所制备的cDNA库所建立EST 资料。草虾EST 的研究目的,是希望了解这些基因与虾的生长、生殖及对疾病反应等特性的相关性
22、。与疾病反应有关的基因表现是目前的研究重点。,现代生物技术在水产养殖病害的检测和防治中的应用,水产养殖生物病原的快速诊断和检测技术,核酸探针技术:该技术具有灵敏度高、特异性强等优点,近年来在对虾病毒病的检测中倍受青睐。美国科学家针对IHH-NV(传染性皮下和造血组织坏死病毒)研制的点杂交核酸探针已经商业化生产。中国科研人员针对对虾造血组织坏死杆状病毒研制的核酸探针,并将之用于检测受造血组织坏死杆状病毒感染的对虾,取得了满意的结果。,PCR技术,PCR技术即聚合酶链式反应:该方法既具有DNA探针方法的灵敏度,又避免了昂贵且危险的同位素的使用,并可以更快得到诊断结果,在对虾病原检测方面,中国研究人
23、员已将这一技术成功地用于对虾病毒病和细菌病的检测。,PCR技术的应用,很多国家均已开发出商品化的造血组织坏死杆状病毒的PCR检测试剂盒。另外,PCR技术与其他技术相结合开发出新的PCR技术更显示出其独特的优越性,如荧光定量PCR技术、PCR-ELISA技术等。现均已应用于水生动物疾病的诊断中,并已显示出巨大的潜力及广阔的应用前景。,单克隆抗体技术,正常淋巴细胞(如小鼠脾细胞)具有分泌抗体的能力,但不能在体外长期培养,瘤细胞(如骨髓瘤)可以在体外长期培养,但不分泌抗体。1975年英国科学家将两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术。,动物细胞杂交(单克隆抗体),B淋巴细胞:能产生特异性强抗体,在体外不
24、能无限繁殖骨髓瘤细胞:不产生专一性强抗体,体外能无限繁殖,动物细胞杂交(单克隆抗体),单克隆抗体技术应用,单克隆抗体技术在对养殖对虾暴发性流行病的病原及传播途径的调查中,发挥了重要作用。应用这一技术,能对养殖对虾的发病情况提前20-40天作出预报,为生产上及时采取对应措施提供了可靠的依据。另外,单克隆抗体技术可以与其它免疫技术相结合,如放射免疫分析技术、酶联免疫检测技术、间接荧光抗体技术等,进而对疾病的检测做到更加准确、迅速。,酶联免疫吸附检测(EL1SA),将抗原或抗体吸附于固相载体上,然后与酶标记的抗原或抗体结合,在适当的底物参与下,使基质水解而呈色,通过呈现的颜色变化来显示抗原抗体特异反
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