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1、第七章 基因治疗,本章目录,7.1 基因治疗的概念与发展7.1.1 基因治疗的概念与策略7.1.2 基因治疗的基本程序7.1.3 基因治疗的现状与展望7.2 基因治疗的载体7.2.1 病毒载体7.2.2 非病毒载体7.2.3 载体与基因治疗中的靶向性问题7.3 重要疾病的基因治疗7.3.1 遗传病的基因治疗7.3.2 肿瘤的基因治疗7.3.3 病毒病的基因治疗,第一节 基因治疗的概念与发展,基因治疗的概念与策略基因治疗的基本程序基因治疗的现状与展望,一、基因治疗的概念,基因治疗（gene therapy）就是向有功能缺陷的细胞补充相应功能基因，以纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治疗的目的。,Na
2、ked DNA,Target Cell,Therapeutic Protein,AAV,Retrovirus/Lentivirus,Adenovirus,Nucleus,Gene Therapy Principles,基因治疗的前提条件,发病机制在DNA水平上已经清楚要转移的基因已经克隆分离，其表达产物有详尽的了解该基因正常表达的组织可在体外进行遗传操作,基因治疗的策略,1）基因置换，就是用正常的基因原位替换病变细胞内的致病基因，使细胞内的DNA完全恢复正常状态。2）基因修复，是指将致病基因的突变碱基序列纠正，而正常部分予以保留。3）基因修饰，又称基因增补。是将目的基因导入病变细胞或其他细胞，
3、目的基因的表达产物能够修饰缺陷细胞的功能或使原有的某些功能得到加强。4）基因失活，利用反义RNA、核酶或肽核酸等反义技术及RNA干涉等技术能特异地封闭基因表达的特性，抑制一些有害基因的表达，以达到治疗疾病的目的。5）免疫调节，这是将抗体、抗原或细胞因子的基因导入病人体内，改变病人的免疫状态，从而达到预防和治疗疾病的目的。,基因治疗的两种途径,1）ex vivo法，是将受体细胞在体外培养，转入外源基因，经过适当的选择系统，把重组的受体细胞回输到患者体内，让外源基因表达以改善患者症状。2）in vivo法，直接将外源DAN注射到机体内，使其在体内表达发挥治疗作用。in vivo法比ex vivo法
4、更简单、直接和经济，疗效也比较确切，常用的体内基因直接转移手段有病毒介导，脂质体介导和基因直接注射等。,二、基因治疗的基本程序,基因治疗的主要步骤目的基因的克隆基因转移系统的建立靶细胞的选择基因的导入。,1.目的基因的选择和制备,用于基因治疗的基因必须满足以下条件：1）在体内仅有少量表达就可以显著改善症状；2）该基因的过高表达不会对机体造成危害；3）外源基因可有效导入靶细胞4）外源基因能在靶细胞中长期稳定存留5）导入基因的方法及载体对宿主细胞安全无害,2.靶细胞的选择,1）生殖细胞基因的转移只能用显微注射，效率不高，并且只适用于排卵周期短而次数多的动物，不适用于人类。所以，这种靶细胞的遗传修饰
5、至今尚无实质性进展。2）体细胞采取基因置换、基因修复等方式，但还不能实现特定位点的基因转移。只能采取基因在基因组上非特定定位，随机整合的方式。只要基因能表达产物就可以达到治疗的目的。是一种异常基因功能补偿的基因治疗方式。,靶细胞的选择,最好为组织特异性细胞细胞较易获得，且生命周期较长离体细胞较易受外源基因转化离体细胞经转染和一定时间培养后再植回体内，仍较易成活,常用的靶细胞,造血细胞皮肤成纤维细胞肝细胞血管内皮细胞淋巴细胞肌肉细胞肿瘤细胞,3.转移载体的选择与细胞转染病毒感染、显微注射、电穿孔、化学转染试剂等。4.外源基因的表达及检测,第二节 基因治疗的载体,病毒载体非病毒载体载体与基因治疗中
6、的靶向性问题,一、病毒载体,逆转录病毒载体 腺病毒载体(AV)腺伴随病毒载体（AAV）,逆转录病毒载体 retrovirus,逆转录病毒,逆转录病毒载体的构建(缺陷型病毒),外源目的基因,逆转录病毒(retrovirus),逆转录病毒载体的构建(缺陷型病毒),逆转录病毒(retrovirus),逆转录病毒载体的包装,逆转录病毒的优缺点,优点,能高效转染宿主细胞，转染率可达100宿主范围广泛可转染大量细胞并长期停留，病毒基因和所载的外源基因都能表达,缺点,病毒容量有限(7 kb)随机插入有致癌作用,2.腺病毒载体(AV),腺病毒的结构,蛋白质外壳包囊外壳蛋白：由纤维状蛋白分子和角蛋白组成 骨架蛋
7、白：起着保持包囊形状的作用 DNA结合蛋白：与DNA结合 线性双链双螺旋病毒DNA,Adenovirus,36 kb Double Stranded DNA Genome,Entry through CAR receptor and integrin co-receptor,腺病毒基因组DNA,基因组长36kb，两端各有一个ITR，ITR内侧为病毒包装信号。6个早期转录基因：E1a,E1b，E2a,E2b，E3,E4，承担基因调控功能1个晚期转录单元(5个晚期基因L1-L5)：负责结构蛋白的编码。E1的缺失可能造成病毒再复制阶段的流产，E3为复制非必须区，可被外源基因替代。,基因组DNA长36
8、kb，两端各有一个ITR，ITR内侧为病毒包装信号。,ITR,ITR,E1,E2,E3,E4,IVa2,VA,L1,L2,L3,L4,L5,ITR是反向重复序列E1-E4为早期基因，与病毒基因组的复制及晚期基因的,表达调控有关，其中E3编码晚期基因的调控因子 L1-L5为编码病毒包装蛋白的晚期基因IVa2和VA均为病毒RNA聚合酶的亚基编码基因。,腺病毒载体的构建,第一代腺病毒载体缺少E1a和 E1b基因，取代的是治疗基因。包装细胞基因组含有E1基因；但第一代腺病毒载体产生炎症，而且基因表达快速衰退；第二代腺病毒载体在删除E1的基础上，或者突变E2区或直接除掉E2或E4区，基因型为E1E2或E
9、1E4。由于保留有E3区，可抑制宿主的免疫反应。第三代腺病毒载体正在开发，目的是尽可能多删除全部的反式序列基因，以降低病毒基因的表达，但腺病毒载体的生产及治疗基因在细胞内的稳定性可能有影响。,腺病毒载体的包装,腺病毒的包装,腺病毒的优缺点,优点,插入DNA片段较长宿主范围广，不需要正在分裂的细胞不整合，减少插入突变的潜在危险,缺点,需反复给药具有免疫原性,腺病毒(adenovirus)载体的优点,复制缺陷型病毒可感染分裂和非分裂细胞病毒颗粒稳定，易于浓缩和纯化可导入多种靶细胞，并持续表达无致癌性,Gelsinger Case,Jesse Gelsinger:18 yr-old from Ari
10、zona,died on 9/17/1999,4 day after gene transfer.,他患有鸟氨酸转氨甲酰酶不足症（OTCD）,接受3.81013腺病毒载体，1到达靶器官肝脏,3.腺伴随病毒载体（AAV）,腺伴随病毒属于细小病毒科，病毒颗粒直径为20nm，无包膜，20面体。是一类单链线状DNA病毒。AAV感染率很高，而且尚无发现AAV引起人体疾病的报道，相反，AAV感染者减少了患癌的机会。,腺伴随病毒载体的基因组,AAV基因组很小，两端也是ITR，中间含有3个启动子和2个编码基因（rep和cap）。REP参与病毒复制、转录的调节，并与基因组的整合有关。而CAP是病毒衣壳蛋白。AA
11、V是一种缺陷病毒，只有在与腺病毒等辅助病毒共转染时才能进行有效复制和产生溶细胞感染。,在人体，AAV特异整合到19号染色体上，是唯一一种以位点特异性方式整合的真核病毒，从而避免了随机整合而导致宿主细胞突变的潜在危险性。AAV载体是缺失病毒结构基因，仅保留两个ITR。使用AAV载体安全，但缺乏高效的包装细胞。,腺伴随病毒载体构建,二 非病毒载体,1.裸露DNA 2.脂质体法,1.裸露DNA,直接注射溶液类型对基因表达有影响：重组DNA可贮存于5%30%的蔗糖溶液中也可用生理盐水或PBS,直接注射法,裸露DNA的转移方法,电穿孔法,微粒子轰击法,2.脂质体法,人造单层膜，是一种脂质双层包围水溶液的
12、脂质微球.结构和性质与细胞膜极为相似，二者易于融合，DNA由于细胞的内吞作用进入细胞。,Liposomes,优点,稳定可携带大片段外源DNA可选择特异的靶细胞无免疫原性,缺点,转染效率较低瞬时表达血清抑制,脂质体的优缺点,Gene Therapy:Delivery Vehicle,第三节 重要疾病的基因治疗,遗传病的基因治疗肿瘤的基因治疗病毒病的基因治疗,一、遗传病的基因治疗,血友病B 地贫 囊性纤维化 腺苷脱氨酶缺乏症,1.血友病B,凝血因子IX缺乏引起，不能正常凝血,薛京伦(复旦大学)1991,腺病毒皮肤成纤维细胞Factor IX:提高 5%2003,rAAV2-hF.IX,地贫是由于珠
13、蛋白基因突变或缺失造成，珠蛋白肽链合成减少，引起患者溶血性贫血。,2.地贫,地贫的基因治疗,基因转移的治疗 向患者的造血干细胞导入正常的珠蛋白基因反义核酸修复 通过反义核酸与目标mRNA特异性杂交，导致异常表达的mRNA降解，或修饰mRNA的剪接或阻碍的翻译。,cftr基因突变引起正常的CFTR引导氯离子穿过细胞膜患者肺细胞分泌过量的黏液，呼吸困难,A child with cystic fibrosis,3.囊性纤维化（CF）,Cystic Fibrosis:Finding the Gene,囊性纤维化的治疗,压缩DNA技术直接将正常DNA导入细胞，补偿患者缺乏的CFTR蛋白,4.严重免疫缺
14、陷症(SCID),1990.9.14 首例基因治疗4岁 女孩 严重免疫缺陷症(SCID)缺乏腺苷酸脱氨酶(ADA)2-脱氧腺苷含量升高 毒性 严重破坏免疫功能,Ashanti de Silva,严重免疫缺陷症(SCID)的治疗,French Anderson(NIH),September 14,1990Retrovirus(Mo-MLV)ADA基因 LN逆转录病毒载体 靶细胞为病人淋巴细胞 回输,Adenosine deaminase,二 肿瘤的基因治疗,1.针对抑癌基因治疗,肿瘤患者50是由于抑癌基因突变导致将正常的抑癌基因导入肿瘤细胞中，以补偿和代替突变或却失的抑癌基因。p53,p16,2
15、.针对癌基因治疗,癌基因是指基因组中能够使正常细胞发生恶性转化的一类基因。采用反义核酸技术，封闭癌基因，抑制其表达。Ras,Myc,Src,3.自杀基因疗法,所谓自杀基因治疗，就是将某些细菌、病毒和真菌中特有的药物敏感基因导入肿瘤细胞，通过此基因编码的特异性酶类将原先对细胞无毒或毒性极低的药物前体在肿瘤细胞内代谢成有毒性的产物，以达到杀死肿瘤细胞的目的。,自杀基因疗法,单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV-tk），编码胸苷激酶，使核苷类似物代谢为二磷酸化物，后者在细胞内酶的作用下成为有毒性的三磷酸化物而发挥抗肿瘤作用。,“自杀基因”疗法,核苷类似物,TK基因,“自杀基因”疗法,TK蛋白,有毒性的三
16、磷酸化物,“自杀基因”疗法,肿瘤细胞死亡,4.耐药基因治疗,多药耐受MDR：指肿瘤细胞接触某一种抗癌药物产生耐药的同时，也对其他结构和功能不同的药物产生交叉耐药性。耐药基因治疗是指将一些耐药基因转移至造血干细胞，以降低化疗药物对骨髓的毒性，这样就可以用高剂量的药物杀死肿瘤细胞而不破坏骨髓细胞。,人类MDR1基因产生一种糖蛋白P-gp,是ATP结合蛋白，对多种抗肿瘤药物产生外排作用。,造血干细胞,肿瘤细胞,糖蛋白,5.抑制血管肿瘤生成,肿瘤的生长和存活依赖于生成的血管为它所提供的氧气和营养物质，阻断肿瘤血管的生成可以抑制肿瘤的生长，防止肿瘤的转移。VEGF是肿瘤诱导血管生成过程中的一个重要的调节
17、因子，引入反义VEGF的cDNA基因，通过与VEGF的mRNA结合，来抑制VEGF蛋白的翻译。,VEGF促进血管生成,VEGF过表达载体植入小鼠角膜诱发异常的血管发生。,RAC基因的过表达可以明显抑制VEGF的血管发生诱导作用。,Circulation.2003;107:1532-1538,三 病毒病的基因治疗,病毒性肝炎 艾滋病（获得性免疫缺陷综合症）,1.病毒性肝炎,主要由肝炎病毒引起，包括甲型肝炎病毒HAV，乙型肝炎病毒HBV，丙型肝炎病毒HCV，丁型肝炎病毒HDV，戊型肝炎病毒HEV。其中主要是HBV和HCV感染较多。治疗的根本方法是阻断、抑制甚至是清除肝炎病毒。采用核酶、反义寡核苷酸
18、、显性失活突变体等方式均可抑制HBV或HCV病毒的基因复制和表达。,艾滋病（AIDS）,艾滋病又叫获得性免疫缺陷综合症由艾滋病病毒HIV感染引起。HIV侵入人体后破坏人体免疫功能，使人体发生多种不可治愈的感染和肿瘤，最后导致被感染者死亡的一种严重传染病。,HIV病毒的分子结构,HIV模型图,脂双层膜,gp120,gp41,包膜糖蛋白,p24衣壳蛋白,p14内膜蛋白,p7核衣壳蛋白,逆转录酶,蛋白酶,整合酶,HIV基因组结构：由两条单链RNA组成，每个RNA基因组约为9.7k，在RNA5端有一帽结构（m7G5ppp5GmpNp）,3端有poly（A）尾巴。HIV的主要基因结构和组合形式与其他反转
19、录病毒相同，均由5末端长重复（long terminal repeat，LTR）、结构蛋白编码区（gag）、蛋白酶编码区（pro）、具有多种酶活性的蛋白编码区（pol）、外膜蛋白（env）和3末端的长重复LTR区组成。,HIV较其他反转录病毒复杂，因为它有较多的调节基因，HIV1基因编码区有很多重叠，尤其在基因组3端。其部分基因如Tat和Rev是不连续的，被插入的内含子分隔成两个外显子。HIV1至少有4个功能性的剪接供体位点和6个剪接受位点.,HIV的生活周期：亲代病毒 与细胞表面CD4分子结合 进入细胞 脱去核心蛋白 cDNA 进入细胞核形成环状DNA 整合进染色体DNA 原病毒 转录成mR
20、NA 子代病毒RNA 组装成病毒颗粒 病毒释放 子代病毒,艾滋病的致病原因,HIV主要通过其表面的包膜糖蛋白与宿主细胞CD4结合，在CCR5或CXCR-4等辅助受体协同帮助下，与细胞膜融合，病毒核心进入细胞内，病毒RNA在逆转录酶作用下合成前病毒。一方面病毒以出芽方式从细胞释放形成新病毒，并感染新细胞，另一方面前病毒与细胞DNA整合而呈潜伏状态。最终导致CD4T淋巴细胞破坏与衰竭，导致机体免疫力下降。,艾滋病的治疗,阻断HIV病毒进入细胞的策略就是用过量的CD4抗原分子或HIV的包膜糖蛋白gp120，来阻断和抑制HIV的感染能力，保护未受感染的CD4细胞。将可溶性的CD4(sCD4)分子的编码
21、基因导入到体外培养的T淋巴细胞中，sCD4分子确实可以阻断HIV1的感染。单链可变区抗体，负显性抑制蛋白，RNA诱捕，细胞内自杀或RNA干涉等方法均可以从不同方面来开展AIDS的基因治疗。,RNAi：RNA干涉技术,RNAi（RNA interference，即RNA干涉）是指通过反义RNA与正链RNA形成双链RNA特异性地抑制靶基因的转录后表达的现象，它通过人为地引入与内源靶基因具有同源序列的双链RNA（有义RNA和反义RNA），从而诱导内源靶基因的mRNA降解，达到阻止基因表达的目的。RNAi现象首先是年在线虫中发现。,RNA干涉的机制,RNAi的应用,基因功能鉴定与功能基因组学基因调控机制的研究药物开发与基因治疗：针对HIV1基因组不同区域构建表达质粒，其产生的小干涉RNA在人细胞系和初级淋巴细胞中均能够抑制HIV1的早期和晚期复制。,
