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1、第 五 章,体外分析技术,重庆医科大学核医学教研室彭志平,定义,以放射核素标记（或其他非放射性标记）的配体(Ligand)为示踪剂，以配体和结合体的结合反应为基础，在试管内进行的微量生物活性物质的检测技术。,体外分析技术是结合了放射性核素的高灵敏度和特异性结合反应的高特异性的一种超微量分析技术，具有灵敏度高、特异性强、精密度好、应用面广、方法简便等优点。,方法学基础,结合反应遵守可逆反应的质量作用定律：k1,v1R+L RL k2,v2,定量手段,放射性测量技术酶定量技术化学发光定量技术,生物学基础：,特异性结合反应：抗原-抗体的免疫结合反应；配基-受体的结合反应；底物-催化酶之间的酶促反应；
2、结合体对：抗原-抗体激素-激素结合球蛋白受体-配体,体外分析技术,体外放射分析,体外非放射分析,放射性竞争结合分析,放射性非竞争结合分析,放射免疫分析(RIA),免疫放射分析,酶免疫分析,化学发光免疫分析,荧光免疫分析,(IRMA),(EIA),(CLIA),(FIA),第 一 节,放射免疫分析法(Radioimmunoassay),Dr.Yalow,在体外条件下,利用Ag与定量的*Ag对限量的特异性Ab的竞争结合反应，通过测定放射性复合物的量来计算出Ag 量的一种超微量分析技术。,一、基本原理,Ag-Ab+Ag,*Ag,Ab,Ag,+,+,*Ag-Ab+*Ag,(B),(F),*Ag与Ag
3、免疫活性相同*AgAg Ab,Ag=*Ag,AgAb=*AgAb,Ag*Ag,*AgAb(B)*Ag(F),Ag*Ag,*AgAb(B)*Ag(F),Ag,*Ag,Ab,*AgAb,AgAb,*Ag,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,Ag,25,50,100,200,400,800,*Ag,Ab,分离B、F,B%=B/(B+F),F%=F/(B+F),R=B/F,B1%,B2%,B3%,B4%,B5%,B6%,1,2,3,4,5,6,浓度,B%,标 准 曲 线,Ag,25,50,100,200,400,800,*Ag,Ab,分离B、F,B1%,B2
4、%,B3%,B4%,B5%,B6%,1,2,3,4,5,6,B%,？,60,在实际的操作中，我们一般要设立以下几个反应管：1最大结合管（Bo）：标准抗原的量为0，只有标记抗原和特异性抗体时，标记抗原与抗体充分反应后分离B和F，所测得的B的放射性为Bo。这是没有标准抗原与之竞争时，标记抗原和抗体的结合达最大值。2非特异结合管（NSB）：标记抗原除了要和特异性抗体结合以外，还要和一些杂质蛋白或容器的管壁等结合，对我们的分析结果产生影响。NSB管是用蒸馏水代替特异性抗体，在相同条件下反应后测得的放射性。3总放射性管（T）：反应后不分离就直接测得的放射性就是总放射性。表示标记抗原抗体复合物和游离的标记
5、抗原的总放射性。4标准管（B1Bn）：放有不同浓度的标准抗原，再加入相同量的标记抗原和特异抗体。一般在反应后分离出沉淀，测定沉淀的放射性作为B。5样品管（Bx）：用同剂量的样品代替标准管中的标准抗原，在相同条件下反应和分离，同样取沉淀测得其放射性，就可以在绘制的标准曲线上找到样品的浓度。,常用的有B%，B/F，B/Bo，F/B，Bo/B等这些反应变量都可以用作纵坐标来对应标准抗原的浓度作标准曲线，选用的反应变量不同，标准曲线的形状也不同。但是这些标准曲线都是反映的反应变量对应标准抗原浓度变化而变化的函数关系。,标准曲线左：横座标为等份刻度；右：横座标为对数刻度,操作基本步骤,1、加样：加样总体
6、积要保持一致，所处的介质环境也要一致。2、孵育：根据不同的分析对象孵育的温度和时间不同，一般是37。3、分离：选择好的分离方法分离游离抗原和抗原抗体复合物。4、测量：测量游离或结合物部分的放射性。5、数据处理：绘制标准曲线和待测物浓度的计算。,二、基本方法,基本试剂,1、抗体,2、标记抗原,3、非标记标准抗原（标准品）,2、标记抗原,1）比活度和放化纯度足够高,比活度每微克抗原上标记放射性核素的千贝可数（KBq/g）,放化纯度具有免疫活性的标记抗原占总放射性的百分数。90%,2）半衰期足够长,3）保持原有抗原的特性,大分子：125I小分子：3H or 125I,3、非标记抗原（标准品）,化学结
7、构、免疫活性与被测抗原相同,高纯度,B和F的分离,1、第一类,2、第二类,双抗体沉淀法,PEG沉淀法,固相第二抗体法,二、基本方法,+,Ag,Ab(1),Ab(2),Ab(2),Ab(1),Ag,可溶性复合物,可沉淀复合物,试管,试管,分离方法的要求,分离完全、快速。不影响免疫反应的平衡，即是要求在分离过程中不使抗原-抗体复合物解离或形成新的复合物。受环境因素（温度、PH值等）的影响小。操作简便，分离剂来源丰富、价廉。,三、质量控制（quality control）,1、精密度（precision）变异系数（CV）7%10%,2、准确度（accuracy）回收率=测定值/真实值100%90%1
8、10%,3、灵敏度（sensitivity）方法的最小可测量,4、特异性（specificity）交叉反应率,5、可靠性（validity）平行性试验,6、稳定性（stability）B0%，NSB，ED25，ED50，ED75,A,B,C,质量控制就是使用合适的方法以检查、表示和消除来自试剂药盒和测量体系的误差，并使这种误差降低到某一允许水平。具体作用有：1检查误差的程度，决定测定结果的取舍。2识别误差的来源并消除其原因。3改进测定方法的设计以提高质量。,RIA 小 结,灵敏度高特异性好精确的定量方法操作简便,第二节 免疫放射分析法,*Ab,+,Ag-*Ab+*Ab,（immunoradio
9、metric assay,IRMA）,B%,Ag,（B）,（F）,在体外,利用Ag与过量的*Ab的非竞争性结合反应，通过测定放射性复合物的量来计算出Ag 量。标记抗体，抗体是过量的。,IRMA与RIA工作原理的主要区别,B%,B%,拟合的标准曲线,拟合的NSB,拟合的标准曲线,拟合的NSB,IRMA的标准曲线及非特异结合曲线,RIA的标准曲线及非特异结合曲线,IRMA和RIA低剂量区的不确定因素示意图,非放射性标记免疫分析技术,酶标记免疫分析技术化学发光免疫分析技术时间分辨荧光免疫分析技术,一、酶标记免疫分析技术：用酶分子代替放射性核素标记抗原或抗体，进行竞争性或非竞争性免疫分析的技术。其中应
10、用最多的就是酶联免疫吸附分析法（ELISA）。是结合了抗原抗体高特异性和酶促反应的高敏感性的检测技术。,ELISA方法是用酶分子标记抗体，进行与IRMA相似的夹心法免疫反应，反应结束后分离结合部分和游离部分，利用结合部分上的酶分子的催化活性将底物转化为特定的颜色，用分光光度计测定，颜色的深浅和酶量成正比，而酶量又和复合物的量成正比。常用的酶是辣根过氧化物酶，底物是四甲基联苯胺(TMB)，反应后显黄色。,二、化学发光免疫分析技术：化学发光免疫分析技术是以化学发光物质代替放射性核素作为示踪物的超微量分析技术。化学发光物质在氧化剂或催化剂的作用下能形成激发态产物，并在退激时将能量转化为光子的物质。,
11、1、化学发光免疫分析：是用化学发光物质作为标记物，标记抗原或抗体，反应以后，利用碱性条件下化学发光物质在氧化物作用下可以发生单光子放射。检测光子的数量就可以反映复合物的量。常用的化学发光物质是异鲁米那和吖啶酯。,2、化学发光酶免疫分析：和ELISA相似，用碱性磷酸酶标记抗体，经夹心法免疫反应后，带有酶的复合物作用于特殊的底物-金刚烷，使底物发射出光子。此法光子发射持续时间较长，可靠性比较好。,3、电化学发光免疫分析(略)4、生物发光免疫分析(略),三、时间分辨荧光免疫分析技术（time-resolved fluoroimmunoassay）,时间分辨荧光免疫分析采用稀土元素标记抗体，利用时间分
12、辨荧光仪特定的延迟时间测量，获得稀土元素的特异荧光信号，同时消除非特异性荧光物质的干扰。,标记物为具有独特荧光特性的稀土金属镧系元素,镧系元素共有15种，应用在时间分辨荧光免疫技术种有四种 钐（Sm），铕（Eu），镝（Dy），鋱（Te）镧系元素荧光重要特点：1、极长的荧光衰退时间 铕：730000ns，钐：50000ns，一般荧光物质：10ns 2、200nm的Stokes位移 铕：激发光340nm，发射光613nm 荧光素的Stokes位移为273nm 3、狭窄的发射峰 4、解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍,时间分辨荧光免疫分析技术（time-resolved fluoroimmun
13、oassay）,一、基本原理,镧系元素（15）：铕（Eu），钐（Sm），镝（Dy），鋱（Te）,Eu,+,Eu,Eu,+,增强液,+,“解离增强镧系荧光免疫分析”,时间分辨荧光检测的基本原理示意图,荧光衰退时间铕：730000 ns钐：50000 ns一般荧光物质：10 ns,铕的荧光,二、TrFIA的特点,1、最大限度提高测量方法的灵敏度2、有与RIA相似的特异性和精密度3、可同时测定两种以上的抗原4、无辐射污染,DELFIA技术的特点为临床检测带来的先进性,总结：体外分析的发展,方法设计的改变：竞争结合分析 非竞争结合分析，代表方法是免疫放射分析标记物的改变：放射性核素 荧光、酶、化学发光、稀土元素结合体的改变,微生物 RMA 酶 REA 受体 RRA 特异结合蛋白 CPBA 改变结合体对放射性技术 Ag Ag-Ab RIA+Ab免疫学技术 Ag Ag-Ab 改变标记物第一阶段 第二阶段 第三阶段,小分子半抗原联接125I单克隆技术固相技术药品化Kit,理论与实践上更丰富更完善的RIA1.可测物达300多种2.涉及多个临床与基础学科 3.RIA显像 4.RIA治疗,荧光 FIA IRMA化学发光 CIA 酶 EIA,
