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1、分子生物学常用技术,核酸的分子杂交 Nucleic acid hybridization,分子杂交的原理：DNA具有变性的特点 变性的DNA还能复性 分子杂交的概念 分子杂交的原理：用已知的DNA序列制成探针，来检测末知的样本DNA。,当条件改变时,当条件复原时,单链DNA被同位素标记后制成探针,核酸分子杂交的基本过程:首先要确定检测的目标，即检测的目的核酸片段，这个片段的序列必须是已知的。根据此设计一个探针（与检测目的核酸互补的序列），并对其进行合成和标记。再通过杂交实验来完成探针对目的核酸的检测。,分子杂交的形式：液相杂交 固相杂交 它们之间的区别和优劣,固相杂交的一般过程 1.首先设计、
2、合成探针。2.收集标本，并提取核酸。3.将提好的核酸样本点到固相支持物上。4.封闭。5.通过变性和复性完成杂交。6.漂洗 7.放射自显影,核酸分子杂交技术的演变 斑点杂交 southern blot northern blot 原位杂交 芯片技术,斑点杂交,southern blot,southern blot,原位杂交,染色体原位杂交,组织切片上的原位杂交,抗衰老基因klotho基因的原位杂交,芯片技术,GeneChip Array Construction,11 m,Millions of copies of a specificoligonucleotide probe,Image of
3、 Hybridized GeneChip Array,500,000 differentcomplementary probes,Single stranded,labeled target,Oligonucleotide probe,GeneChip Array,Hybridized Probe Cell,1.28cm,1.28cm,DNA,RNA,DNA and RNA Monitoring,Genotyping:Is it A or B?,Gene Expression:Which genes?How much?,Eukaryotic Cell,Dec 2002 Golden Path,
4、Blue=STR from CIDR panel Black=Gaps,Median intermarker distance:4.7 MbMean intermarker distance:5.6 MbMean genetic gap distance:8.9 cMAverage Heterozygosity 0.76,Median intermarker distance:105 kbMean intermarker distance:210 kbMean genetic gap distance:0.32 cMAverage Heterozygosity 0.37,Dec 2002 Go
5、lden Path,Red=at least 1 SNP per 100 kb Black=Gaps,10k Coverage:Genome 11,555 SNPs,Median intermarker distance:8.5 kbMean intermarker distance:23.6 kbAverage Heterozygosity 0.30Average minor allele frequency 0.22,July 2003 NCBI bld 34,Red=at least 1 SNP per 100 kb Black=Gaps in genome coverage,Mappi
6、ng 100K Coverage:116,204 SNPs,92%of genome within 100kb of a SNP 83%of genome within 50 kb of a SNP 50%of genome within 15 kb of a SNP 25%of genome within 5 kb of a SNP,聚合酶链式反应,Polymerase chain reaction(PCR),PCR技术的形成及发展,PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给
7、DNA的体外合成提供一种合适的条件摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间,合成DNA的原料。,PCR示意图,PCR的改进与完善,Mullis最初使用的 DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺点是：Klenow酶不耐高温，90会变性失活，每次循环都要重新加。引物链延伸反应在37下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一
8、次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视,1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：耐高温，在70下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95下反应2h后其残留活性是原来的40%。在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I K
9、lenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现为PCR技术的广泛应用打下了基础。,PCR 技术的实验原理,模拟细胞内DNA合成的过程 利用了DNA变性、复性和能进行杂交的特点，在引物存在的条件下DNA聚合酶开始对DNA进行体外合成。通过全自动的热循环仪来完成,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,模板DNA,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的
10、特点,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第2轮结束,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,PCR反应的基本条件,模板的制备 模板是进行DNA体外扩增的依据，它的来源于不同的材料。PCR对模板的质量要求很高，但对它量的要求不高。制备模板的材料：新鲜材料：人或动物的血液及组织中提取；从少量材料：痰、尿液、腹腔液等;法医学的材料：血斑、精斑等；考古材料 从以往保存的材
11、料，如石蜡切片的蜡块中。提取的原理和方法：（略）,引物的设计：引物的设计首先要依据你已知的序列来设计。即你要扩增的目的DNA片段。这些资料可以从文献上查找或从互联网上来检索。实际做的过程中，引物也可借助于别人已经发表的引物来。但从经验上说，别人公开发表的引物常常含有一定的错误。所以要进行核查。,设计引物应遵循以下原则：引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶 核苷酸的成串排列。
12、避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。,引物-3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.11umol或10100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。,PCR所用试剂：DNA聚合酶 buffer:包括两种，一种是
13、含Mg+，一种是不含Mg+。dNTPs 纯净水自己要准备的模板DNA的制备和引物的设计与合成。,PCR的操作过程,设定一个加样配方：标准的PCR反应体系：10扩增缓冲液 5ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至 50ul,加样：单样本加样 多样本加样 加样的顺序PCR反应条件的设定：预就性温度：94，5分 变性温度：94，30秒 退火温度：需要摸条件 延伸温度：72，30秒 总延伸温度：72，15分,重复13步2530轮,目的DNA片段扩增100万倍以上,DN
14、A双螺旋,DNA单链与引物复性,DNA变性形成2条单链,子链延伸DNA加倍,PCR运行图,PCR结果的鉴定,通过凝胶电泳的方式来进行。,RT-PCR(reverse transcription-PCR)RTPCR的原理,RTPCR技术的应用用于制备基因工程的目的基因片段。用于表达谱的检测。,PCR技术的应用,PCR的初衷是为特异性的扩增某段DNA现在PCR在医学研究中主要是用于基因诊断，常用于：对遗传病的突变基因进行诊断 对病原体的基因诊断 通过PCR结合限制酶切的诊断 SSCP技术进行点突变的诊断RT-PCR进行结构基因的扩增及定量表达荧光定量PCR技术,PCR结合多态性分析,PCR扩增产物
15、的多态性分析有2种情况：限制片段多态性分析(A)、(B)重复序列多态性分析(A)、(C),PCR-限制片段多态性分析,重复序列多态性分析,SSCP技术进行点突变的诊断,实时荧光定量PCR技术,电泳技术,electrophoresis technology,核酸的凝胶电泳一、基本原理 1核酸分子在水溶液中呈多聚阴离子。加上电场，它们会向正电极的方向迁移。2在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于核酸分子本身的大小和构型。,3电泳环境的影响：缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移速度。当电泳缓冲液中无离子时，溶液导电性极小，电泳速度慢。当电泳缓冲液中离子浓度极强时，则导电性极高，并易产热。pH值
16、也影响迁移率，溶液的pH远离样品的等电点时，样品颗粒的电离程度大，相应的电泳速率就大。凝胶的浓度的不同对同样大小颗粒的电泳速率也不相同，因此，不同浓度的凝胶分辨DNA分子大小的能力也不同。,表：琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力 凝胶类型及结构 分离DNA片段的大小范围(bp)0.3%琼脂糖 50 000-1 000 0.7%琼脂糖 20 000-1 000 1.4%琼脂糖 6 000-300 4.0%聚丙烯酰胺 1 000-100 10.0%聚丙烯酰胺 500-25 20.0%聚丙烯酰 50-1,4凝胶电泳的目的：可将大小不等的DNA片段和蛋白分子进行分离，并通过标准分子量maker
17、鉴定其大小。对所要的目的分子进行纯化提取。,二、琼脂糖凝胶电泳Agarose Gel Electrophoresis琼脂糖是从海藻中提取出的长链状多聚糖，当它被加热到90时可被溶解成半透明的液体，这时便于浇板并在冷却后固化成凝胶。其凝固点这40-45。琼脂糖电泳的优点：操作方便，并可用来鉴定和纯化特定的DNA分子。,Agarose Gel Electrophoresis,-,+,1,2,4,6,8,10,12,kb,不同浓度下电泳的迁移速度,用低溶点琼脂糖来分离并纯化DNA。琼脂糖电泳的不足之处：它的分辨范围在0.3-50kb之间，对一些分辨更小DNA分子的实验将无法进行。琼脂糖电泳结果的显示
18、：利用核酸与溴化乙锭吸附性强的特点，用溴化乙锭来显色。,三、聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)电泳材料：丙烯酰胺 CH2CHCNH2 O N,N-亚甲双丙烯酰胺 H H CH2CHCNCH2NCHCH2 O,+,Electrophoresis,两种丙烯酰胺在促凝剂存在的条件下可以凝集成胶。PAGE的优点和不足：优点是分辨率高，不足是操作复杂，成本高。PAGE的凝胶可用溴化乙锭染色，也可以银染，后者的分辨率高。,溴化乙锭染色,硝酸银染色,四、SDS-变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SOS-polyacrylamide gel electr
19、ophoresis,SDS-PAGE)SDS-PAGE专门用于蛋白质电泳。基本原理：在蛋白质电泳前，先将其变性成线结构，并使其表面都吸附上带负电荷的活性分子-SDS。,考马斯亮兰染色SDS-PAGE,蛋白质印迹技术,Western blot,Western blot 技术是借鉴了Southern blot 技术的原理而设计。它也是在凝胶电泳后通过转移电泳将电泳分离物移到固相支持物上再进行进一步的分析。与Southern blot不同的是，它用来杂交的不是探针，而是特异性的物体。,Western blot的基本过程先通过SDS-PAGE将样本中的蛋白质分离通过转移电泳将凝胶上的样本移到硝酸纤维膜
20、上封闭硝酸纤维膜用一抗来特异性的识别目标蛋白用酶标二抗来识别一抗显色,Western blot 流程图,Western blot 的识别原理,转移后的固定物,显色后,Western blot 的应用,DNA序列分析,(DNA sequence analysis),Sanger双脱氧终止法(手工测序)基本原理：DNA在复制时，需要两个单核苷酸之间脱去一分子水后形成磷酸二酯键。如果在其中加入双脱氧的单核苷酸，将中止DAN的复制。,电泳,双脱氧法DNA测序原理,通过自动化的DNA测序仪来进行测序测序的基本原理：,二、基因组的大规模的测序列,Genome Sequencing-Review,Libra
21、ries,Sequencing,Release,Assembly,Annotation,Closure,Strategy,Assembly,Libraries,Strategy,Sequencing,Closure,Annotation,Release,新一代测技术的出现 第二代测序技术的核心思想是边合成边测序（Sequencing by Synthesis)，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列，现有的技术平台主要包括Roche/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system。,图(b)
22、：利用分子动力学模拟软件，在Van De Waals绘景中做出的器件图。其中，纳米孔是氮化硅-金电极-氮化硅的三明治结构，中间的金电极用于测量DNA通过时的横向隧穿电流，两端的绝缘氮化硅材料用于把金电极跟水溶液隔离开来，游动在纳米孔中的是单链DNA分子，红白相间的小颗粒是水分子，间杂其中的是氯离子和钾离子。整个测序必须在常温下的溶液环境中完成。,新一代测序技术的优点：快速、成本低。,酶联免疫吸附分析,Enzyme-linked immunosorbentassay(ELISA),基本原理：通过免疫学技术(抗原、抗体反应)对样本中的目标蛋白质进行特异性的定性或定量分析。被检测的蛋白质即可能是抗原，也可以是抗体。基本过程：1.将抗体或抗原结合到固相支持物上 2.用特异性的抗原或抗体(被酶标记)对其进行免疫识别。3.通过酶标仪来检测结果,ELISA常用的方法有：双抗体夹心法 间接法,双抗体夹心法,
