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1、1/40,限制性核酸内切酶,DNA聚合酶,连接酶,核酸酶,基因工程的工具酶,2/40,核酸酶（nucleases）,核酸外切酶2.核酸内切酶,3/40,DNA分子糖-磷酸主键的破坏称为切口（nick）DNA分子中核苷酸缺失称为缺口（gap）,连接修复3端羟基和5端磷酸基团，形成3-5磷酸二酯键,连接酶 DNA ligase,T4噬菌体DNA连接酶,4/40,T4-DNA连接酶（T4-DNA Ligase）,来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌,连接双链DNA上的单链口（Nick），亦可连接限制内切酶所产生的粘性末端。,连接平头双链DNA速度很慢，在高浓度的底物和酶的作用下方可进行，分子之间的连接。,
2、反应条件：pH为7.57.6，平端连接用20-25，粘端连接用12左右。,Use,5/40,Animation of the ligation process.When the sticky ends of two DNA fragments come together and hydrogen bond through the A-T and G-C pairing,the enzyme LIGASE will form covalent bonds between the two fragments.,6/40,The Specific Cutting and Ligation of DN
3、A,EcoRI,DNA Ligase,EcoRI sticky end,EcoRI sticky end,7/40,DNA聚合酶（以DNA为模板合成DNA）,RNA聚合酶（以DNA为模板合成RNA）,逆转录酶（以RNA为模板合成DNA）,聚合酶（polymerase）,8/40,大肠杆菌DNA聚合酶I,(大肠杆菌DNA聚合酶I)Klenow片段,T4 DNA聚合酶,T7 DNA聚合酶,Taq DNA聚合酶,反转录酶,DNA聚合酶,9/40,一、大肠杆菌DNA聚合酶 I,1 三种酶活性,1）DNA聚合活性,dTTP,3,1、聚合反应具有方向性:5 3,2、DNA 聚合酶不能催化两个游离的脱氧核苷
4、酸聚合，只能在一段寡核苷酸的 3-OH 逐个添加脱氧核苷酸，使核苷酸链不断延长。,10/40,3,3,引物,11/40,2）核酸外切酶活性,12/40,5,3,2 应用,1)切口移位法标记DNA 在DNase的作用基础上产生链内切口，应用此酶的53聚合酶活性和53外切核酸酶活性的同步联合反应，使切口沿DNA链从5-端向3-端移动。若用于聚合反应的原料dNTP带有放射性核素32P，就能使生成的双链带有标记物。,13/40,14/40,5,3,5,3,2)3-粘端的末端标记 先利用此酶的35外切核酸酶活性，切除凸出的3-粘端，形成5-凸出粘端；再以其53聚合酶活性使其补平，在高浓度的dNTP条件下
5、，使3-端的外切反应与dNTP的搀入反应达到平衡。若dNTP中有放射性标记的核苷酸，即可使产物成为3-末端带标记的DNA。,15/40,裂解变性,显影,16/40,3 合成cDNA的第二链,cDNA,5,3,5,3,17/40,53聚合酶活性：催化单核苷酸到 DNA 3-OH端,35外切酶活性：从游离的3端降解单核苷酸,53外切酶活性：从游离的5端降解双链DNA成为 单核苷酸,大肠杆菌DNA聚合酶I（E.coli DNA pol I）,1.随机引物标记核酸探针2.5-粘端补平或3端标记3.合成cDNA的第二链4.DNA序列分析5.3-端的末端标记,应用,18/40,小片段,N 端,C 端,大肠
6、杆菌DNA聚合酶 I,19/40,蛋白酶降解DNA聚合酶 I 获得其大片段称为Klenow片段，只有 53聚合酶活性,35外切酶活性。,Use,催化DNA切口平移反应，制备探针对DNA分子进行末端标记,20/40,催化以 RNA 为模板的 DNA 聚合反应,催化合成出互补DNA（cDNA）可构建cDNA文库,Use,complementary DNA,二、反(逆)转录酶(RNA依赖/指导的DNA聚合酶),21/40,催化dNTP DNA分子中3-OH端,给载体或cDNA加上互补的多聚体尾巴;DNA片断3末端标记,在Mg2+条件下，选择3OH端单链DNA为引物加成核苷酸，在Co2+存在的条件下，
7、选择3OH端双链DNA为引物加成核苷酸，形成多聚核苷酸尾。,末端转移酶（TdT）,5 p,3 HO,OH 3,p 5,TdT,Mg2+dATP,5 p,3 HO,AAAAAAAAAAAA OH 3,p 5,不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs,22/40,5 p,3 HO,OH 3,p 5,TdT,Co2+,dATP,5 p,3 HO AAAAAAAAAAA,AAAAAAAAAA OH 3,p 5,5 p,3 HO,OH 3,p 5,TdT,Co2+dATP,5 p,3 HO,AAAAAAAAAAAAAA OH 3,p 5,AAAAAAAAAAA,23/40,催化切除DNA、RNA和d
8、NTP上的5磷酸基团,切除5磷酸防止自身连接标记前去除5磷酸,Use,5P-DNA 5OH-DNA+Pi5P-RNA 5OH-RNA+Pi,碱性磷酸酶(去除5P),常用的碱性磷酸酶,细菌碱性磷酸酶（bacterial alkaline phosphatase，BAP）,小牛肠碱性磷酸酶（calf intestinal alkaline phosphatase，CIP）,24/40,Use,标记DNA链的5端连接反应中磷酸化,将NTP的-磷酸转移到ds/ss DNA/RNA的5-OH,来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌,T4-多核苷酸(磷酸)激酶（T4-Polynucleotide kinase）,25/40,DNase,RNase,核酸酶S1,水解DNA,水解RNA,降解单链DNA和RNA用量增大可降解双链核酸，用于切去双链-cDNA合成中产生的发夹环。,核酸酶,26/40,重组DNA技术中常用的工具酶,
