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1、第十五单元免疫学技术概论,南京农业大学张 炜,电话：13814076553Email:,第1节 概 述一、免疫学技术的概念及分类,免疫学技术是利用抗原抗体特异性反应的原理建立的各种检测与分析技术，以及建立这些技术的各种制备方法。分为免疫血清学技术免疫制备技术细胞免疫技术,二、免疫血清学反应的特点及影响因素,一般特点特异性与交叉性抗原与抗体结合力最适比例性反应的阶段性,影响因素电解质温度酸碱度,血清学反应具有高度特异性，如抗猪瘟病毒的抗体只能与猪瘟病毒结合，而不能与口蹄疫病毒结合。若抗原之间含有部分共同抗原时，则发生交叉反应。,特异性与交叉性,抗原与抗体结合机理,抗原和抗体的结合为弱能量的非共价
2、键结合，其结合力决定于抗体的抗原结合位点与抗原表位之间形成的非共价键的数量、性质和距离，可分为高亲和力、中亲和力和低亲和力抗体。,抗原与抗体在适宜的条件下就能发生结合反应。但对于血清反应，只有在抗原与抗体呈适当比例时，结合反应才出现可见反应，在最适比例时，可见反应最明显,Ag浓度,Ag Ab复合物,前带,后带,等价带,免疫血清学反应的影响因素,电解质 特异性的抗原和抗体具有对应的极性基（羧基、氨基等），它们互相吸附后，其电荷和极性被中和因而失去亲水性，变为憎水系统。此时易受电解质的作用失去电荷而互相凝集、发生凝集或沉淀反应。温度：通常在37度酸碱度：常用pH为6-8,三、细胞免疫技术的种类,淋
3、巴细胞计数及分类技术淋巴细胞功能测定技术细胞因子检测技术体内细胞免疫试验,四 免疫制备技术的种类,抗原制备抗体制备抗体纯化抗体标记,抗原制备,常见的抗原种类：细菌、病毒及其亚组分如果是活的微生物，还需要进行灭活处理,抗体制备,血清抗体制备按一定的免疫程序对实验动物进行一次或多次免疫。分离血清,五、免疫学技术的应用,动物疫病的诊断动植物生理活动研究物种及微生物鉴定动植物性状的免疫标记生物制品研究动物疫病致病机理研究分子生物学研究,六、免疫学技术的发展趋向,第2节 凝集反应,细菌、红细胞等颗粒性抗原，或吸附在红细胞、乳胶颗粒性载体表面的可溶性抗原，与相应抗体结合，在有适当电解质存在下，经过一定时间
4、，形成肉眼可见的凝集团块，称为凝集试验（agglutination test）参与的抗体主要是IgM和IgG。分为：直接凝集试验间接凝集试验,一，直接凝集试验,颗粒性抗与相应抗体直接结合并出现凝集现象的试验称为直接凝集试验（direct agglutination test）分类：玻片法和试管法原理：抗原抗体结合形成可见反应。,二，间接凝集试验,将可溶性抗原（或抗体）先吸附于一种与免疫无关的，一定大小的不溶性颗粒（统称为载体颗粒）的表面然后与相应抗体（或抗原）作用，在有电解质存在的适宜条件下，所出现的特异性凝集反应称为间接凝集反应，以此建立的检测方法称为间接凝集试验（indirect aggl
5、utination test）,间接凝集反应原理：,+,+,载体：红 血 球：间接血凝试验 乳胶颗粒：间接乳胶凝集试验,二、抗原或抗体的检测方法,第3节 沉淀试验,可溶性抗原 如细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液、病毒的可溶性抗原，血清等与相应抗体结合，在适量电解质存在下，形成肉眼可见的白色沉淀，称为沉淀试验（precipitation test）参与的抗体主要是IgM和IgG。,沉淀试验可分为液相沉淀试验和固相沉淀试验液相沉淀试验主要有环状沉淀试验和絮状沉淀试验等。固相沉淀试验主要是琼脂扩散试验和免疫电泳试验。,(一)环状沉淀试验（ring precipitation test）,小口径试管中
6、进行，先加已知血清0.1 ml，然后轻轻加入等量抗原，形成二个界面，数分钟后，二个界面间形成乳白色的沉淀环。如：炭疽环状沉淀反应:Ascoli 反应,（二）琼脂凝胶扩散试验,利用可溶性抗和抗体在半固体凝胶中进行反就，当抗原抗体分子相遇并达到适当比较时，就会互相结合、凝集，出现白色的沉淀线，从而判定相应的抗体和抗原。双向双扩散（double diffusion in two dimension）双向单扩散（simple diffusion in two dimension）,双向免疫扩散(double immunodiffusion)：-定性检测Ag或Ab；Ab效价滴定,（二）沉淀反应,三、免疫
7、电泳技术,免疫电泳 对流免疫电泳,、免疫电泳（immuno electrophoresis),+,标本先电泳,两侧挖槽加Ab孵育后出现肉眼可见沉淀,-,（二）沉淀反应,第4节 标记抗体技术,标记抗体技术是应用最为广泛的免疫血清学技术，主要有以下3大类。免疫荧光抗体技术免疫酶技术放射免疫分析,免疫荧光抗体技术（immunofluoresecnce antibody technique）是指用荧光素对抗体或抗原进行标记，然后用荧光显微镜观察荧光以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。其中，最常用的是以荧光素标记抗体或抗抗体，用于检测相应的抗原或抗体。染色的方法分为直接法和间接法,二、免疫荧光抗体技术,免
8、疫荧光抗体技术的应用,细菌学诊断病毒病诊断其他方面的应用,第2节免疫酶标记技术,原理酶标抗体技术是根据抗原抗体反应的特异性和酶催化反应的高敏感性而建立的起来的免疫检测技术。,（一）常用的免疫酶标记技术,酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay，ELISA）免疫酶组织化学染色技术斑点-酶联免疫吸附试验,常见的酶联免疫吸附试验,直接法间接法双夹心法竞争法,ELISA检测抗原,Ag+Ab*Ag-Ab*,ELISA检测抗体,检测对象,间接ELISA检测抗体,检测对象,夹心ELISA检测抗原,检测对象,竞争ELISA检测抗原,竞争,第3节 放射免疫技术,是将
9、放射性同位素测量的高度敏感性和抗原抗体反应的高度特异性结合起来而建立的一种免疫分析技术。,第5节 中和试验,一、概念和原理,中和试验是基于抗体能否中和病毒的感染性而建立的，具有严格的种、型特异性。凡能与病毒结合，使其失去感染力的抗体称为中和抗体，能与细菌外毒素结合，中和其毒性作用的抗体称为抗毒素。,三、方法的分类及应用,中和试验主要有两种：一是测定能使动物或细胞死亡数目减少至50%（半数保护率，PD50）的血清稀释度，即终点法中和试验。二是测定使病毒在细胞上形成的空斑数目减少至50%的血清稀释度，即空斑减少法中和试验。毒素和抗毒素也可进行中和试验，其方法与病毒中和试验基本相同。,（一）毒价的滴
10、定,病毒的半数剂量测定时，通常将病毒原液作10倍递进稀释，选择4-6个稀释倍数接种一定体重的实验动物。观察一定时间内的死亡或细胞病变数。然后按一定方法算出LD50（半数致死量）、ID50（半数感染量）等,二、终点法中和试验,1、固定血清稀释病毒法 将病毒用2倍递增稀释，分置二列试管：第一列加入正常血清（对照组）；第二列加入待检血清（试验组）。二列试管分别振荡均匀，置37度中作用1h，将各管混合液分别接种试管动物，每管用3-5只动物。接种后观察数目，并记录死亡数。观察结束后，计算起LD50及中和指数。,2、固定病毒稀释血清法 本法用以测定抗病毒的血清中和效价。将待检血清稀释，加等量已知毒价的病毒
11、液，在试管内中和接种动物，观察动物发病及死亡情况，计算其只能中和效价。,（三）空斑减少试验,在细胞培养时作中和试验可采用空斑减少法。一种能使细胞致病变的病毒，在细胞培养上生长后，因其致病变作用使细胞单层脱落，pH与无病变地方也不一样，该处与周围明显不同的、一个局限性的变性细胞区称为空斑。一个空斑可以当作一个病毒生长的集落，一个单位内空斑数多，病毒就多，故可测出病毒空斑形成单位。这样，加抗血清与不加抗血清的病毒空斑形成单位之差，就称为空斑减少试验。使空斑减少50%的血清稀释度，就是该血清的中和价。,第6节 补体参与的检测技术,概念：利用补体能与抗原抗体复合物结合的性质，建立起来检测抗原或抗体的免疫学试验。,第7节 免疫检测新技术,SPA免疫检测技术生物素-亲和素免疫检测技术免疫胶体金检测技术免疫电镜技术免疫转印,免疫沉淀PCR-ELISA技术化学发光免疫检测定免疫传感器免疫核酸探针技术生物芯片,谢谢,
