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1、实验室检（监）测在健康养殖中的应用,王恩峰 2015年2月,报告内容,病料采集及运输的要求,检测报告实例解读,、血清学检测在疾病防控中的应用,认识检测的目的和意义,如何开展检测工作,病料采集及运输的要求,1、病料组织全面：脾脏、肺脏、肾脏、淋巴结、扁桃体，肠道与脑单独保存伪狂犬必须有脑，最好是小脑药敏及细菌分离禁止冷冻病料病理切片现场固定，避免组织自溶，2-3cm切记病料不要太大，尤其肝肺，选病变明显部位各样品间不要污染，做好标记流产胎儿带脐带，特别是日龄小的有客户自己解剖，喉头不是扁桃体，注意区分,2、血液前腔静脉（小猪）或耳缘静脉（大猪）采血2-3ml，斜面放置待血液凝固后尽快送检冷藏不冷
2、冻，送检时切勿剧烈震荡血样，溶血、腐败编号清晰，注明猪群类别及检测项目尽量附免疫程序，便于分析如果运输路途较远，血液凝固析出血清后，收集血清送检，送检时在箱内放冰袋或冰冻矿泉水瓶。,3、水样 无菌取500ml水后放至灭菌玻璃瓶或刚开封的矿泉水瓶（倒掉矿泉水）中，送检时在箱内放冰袋。4、饲料或饲料原料取有代表性样品，放入样品袋或牛皮纸袋中直接送检。,认识检测的目的和意义,3,限制养猪生产水平进一步提升的关键因素：缺乏持续维护猪群健康的系统科学手段；普遍带毒生产，对疾病的净化缺乏科学的认识；PRRS的不稳定是最大的健康制约因素；实验室建了不少，但对实验室检测的重视只是在口头，缺少真正将实验室工作与
3、生产紧密结合的策略研究和人才。,实验室检测的目的正确引种检测；评估免疫效果；制定免疫程序；临床疾病诊断；疾病风险预警；重要疾病净化；协助健康管理。,病原学、血清学的检测技术（1）可以真实获取猪只健康状态、感染、免疫、发生疫病 等方面阶段性的准确信息；（2）所获信息具有特殊的意义：血液内部信息的变化是动态的，血液循环是生命机体最重要的缓冲体系，动物机体的任何生理变化都会通过血液客观、准确的反映出来；信息的实时性和前置性；（3）可以数字化阅读，进行定性定量的分析。,感染动物,健康动物,疾病控制,健康动物,疾病控制,健康动物,在引入前进行检测，发现风险动物,风险动物,健康动物,引进安全无风险的猪只,
4、健康动物,确保有效免疫，以防疏漏,猪病监控是规模化猪场管理中最关键的环节,采样,检测,分析,策略,如何开展检测工作,1.检测的目的要明确2.正确合理的采样3.准确的ELISA操作4.准确解释检测结果5.制定净化或清除计划,1.检测的目的要明确 A.评估疫苗免疫方案的效果 B.预测接种时间:母源抗体存在下测定免疫最佳时机 C.分析猪场存在的疫病风险 D.进行引种检测和策略性的措施 E.制定控制和根除猪病方案,1.检测的目的要明确 A.评估疫苗免疫的效果,弱毒疫苗免疫后4-6周采样，常见疫苗有：猪瘟，猪伪狂犬，猪蓝耳病等；灭活疫苗免疫后6-8周采样，常见疫苗有：猪口蹄疫，猪传染性胸膜肺炎，猪喘气病
5、等。,1.检测的目的要明确 B.预测接种时间:母源抗体存在下测定免疫最佳时机,母源抗体不能通过胎盘屏障,只能通过初乳(所以子猪 母源抗体水平不均匀)；母源抗体对弱毒疫苗的免疫起明显的干扰作用；一般情况下母源抗体可维持到4-5周,PRV Mab可能维持到8-10周。,例：猪瘟疫苗首免日龄的选择,1.检测的目的要明确 C.分析猪场存在的疫病风险,如何分析？,1.检测的目的要明确 D.进行引种检测和策略性的措施,引种最大的风险是造成疾病的爆发PRRSV易变特性导致不同猪场病原学上的差异CSF/PR/PRRS 抗原/抗体检测是必不可少的步骤,1.检测的目的要明确 E.制定控制和根除猪病方案,当感染率低
6、于一定比例,如猪瘟野毒/猪伪狂犬病感染率在1%/10%以下时,控制策率可转入根除策略。在目前国内情况下,猪蓝耳病根除(和维持阴性群)的工作相当困难，所以大部分场采用控制策略。,2.正确合理的采样 普查原则:,针对猪场所关注的或区域流行严重的疾病依据“群”的概念抽样群内猪只所涵盖的特性:胎龄结构,周龄群体数量少于30头的建议全群采样普查频率:至少2次/年,2.正确合理的采样“群”的概念:,公猪群(正在配种和暂停使用的公猪)后备群(引进或本场留种的公猪和母猪)怀孕母猪群(配种后-分娩前母猪)分娩后母猪群(含断奶后配种间隙母猪)产房乳猪群(断奶前乳猪)保育猪群(4-10周龄仔猪)育肥猪群(11-25
7、周左右),血清学检测在疾病防控中的应用,CSFV与BVDV是病毒中最为类似的两种病毒，所以猪瘟抗体ELISA试剂盒要与BVDV无交叉反应BVDV：牛病毒性腹泻病毒（孙龙飞）BVDV可以造成猪瘟检测的假阳性（IDEXX无交叉反应）从猪群中分离到BVDV病毒证实了猪群存在感染BVDV在猪群中可以引起类似猪瘟的症状和病变,一、CSFV检测,监测用途：母源抗体的监控，确定首免日龄评估免疫后抗体水平免疫程序评估及调整,1、引种检测:后备公猪/后备母猪引进时(4-6月龄)CSFVAb:随机采样CSFVAb Blocking50%CV50%,CV50%,CV40%为免疫合格，检测频 率:4次/年(30样本/
8、次/群),二、PRRS在规模化猪场疫病中的地位和防控,规模化猪场的PRRSV危害及现状PRRS的实验室检测能取得什么基本信息如何评价免疫的效果定期常规检测的目的意义健康管理检测方案在生产中的应用,危害：母猪繁殖性能低下（母猪产后发情不正常；非生产天数较长；受胎率低，返情率高，分娩率低，产活仔数低；无预兆性、反复发生在产房的初生仔猪腹泻（PED）；保育猪间歇性难养（发热、衰竭、呼吸困难、死亡率增高）；生长育肥猪死亡率增加；猪瘟抗体水平低下、口蹄疫散发；种猪伪狂犬病阳性率骤增（甚至出现临床症状）；在所有感染、发病群体病原的检测中，PRRSV是检出率最高的病原。,1、规模化猪场的PRRSV危害及现状
9、,现状：规模化猪场PRRSV阳性普遍，且大部分持续性感染；目前我国完全经典PRRSV感染的阳性猪场只是极少数，HP-PRRSV变异株阳性场越来越多或成为主导性毒株；PRRS的防控始终遭遇瓶颈（虽然采用了分点式生产、全进全出、药物、PRRS疫苗免疫、支原体和圆环病毒免疫、消毒等能想到的方法无所不用其极）；依赖PRRS疫苗免疫的防控手段，目前不断面临新的问题和挑战。,2、PRRS的实验室检测能取得什么基本信息,2014年PRRSV流行毒株分子流行病学分析：2014年分离的毒株，除极少数属于第2亚群，其余98%以上均属于第4亚群，具有与高致病性毒株相同的分子特征；分离毒株的变异状况 核苷酸、氨基酸的
10、变异与2011-2013年相比有逐步加快的趋势，核苷酸、氨基酸同源性分别下降了0.51%、0.5%，与经典毒株的差异逐渐在拉大；尤其是部分毒株糖基化位点有“减少并向前移位”的趋势，说明病毒有结构性变异的风险。在生物安全管理混乱、群体流动性大、生产性能持续不稳定的猪群，PRRS毒株变异情况越快且复杂。,病毒,淋巴器官,肺脏,其他组织,24小时侵染所有的淋巴组织和肺脏,7-14天血清、淋巴结的病毒滴度达到高峰,病毒滴度迅速增加,在分化良好的单核细胞中复制,（1）抗体与PRRSV形成免疫复合物，借助细胞表面的FC受体与巨嗜细胞结合，增加PRRSV进入巨,嗜细胞的机会。（2）分化细胞：促进肺泡巨噬细胞
11、和肺血管内巨噬细胞的复制。,毒株毒力 个体免疫能力,外部因素进入局部的易感巨噬细胞内复制血清学稳定,12小时出现病毒血症抗体依赖现象（ADE）,临床不稳定,S/P值在稳定范围内，生产性能稳定,血清学不稳定S/P值超出稳定范围，,生产性能略有波动（也可能不波动）,S/P值大幅超出稳定范围，生产出现损失，猪难养.,PRRS的实验室检测,3、如何评价免疫的效果,PRRS免疫有效吗免疫或闭群能清除病毒吗造成群体PRRS不稳定动态变化的原因理想的免疫效果,PRRS免疫效果验证 某猪场自家血清驯化（攻毒80个病毒粒子）：阴性猪、阳 转猪、免疫猪的比较（各100头4-5月龄后备猪）,免疫或闭群是否能清除PR
12、RSV免疫和闭群是不能清除PRRSV的；病毒的清除与个体的健康状况正相关，大部分健康的种猪一般在40-60天内即可清除病毒，健康水平差的个体将出现持续的病毒血症；不稳定的群体在免疫后，不稳定的个体并不会因为弱毒疫苗免疫而稳定下来；相反，可能将出现不稳定性（抗体依赖现象）的增强作用（特别是批间差大的疫苗）,群体PRRS状态不稳定的动态原因种猪群体中的持续带毒个体，比例越多越不稳定；精液带毒的公猪；PRRS不稳定后备猪；健康状况差的带毒断奶母猪；使用不同品牌的疫苗，尤其在使用的早期。,理想的免疫效果 PRRS的免疫受品牌、猪群健康状况、生产流程、公猪、后备猪等多方面的影响，理想的结果：免疫4周抗体
13、达到峰值，然后趋于稳定并稳定下降；绝大多数个体S/P值处于稳定区间内，呈正态分布；群体离散度小于60、S/P平均值处于1.2以内；免疫稳定的母猪，将生产出30日龄抗体阴性的断奶仔猪，8-10周龄仔猪检不出PRRSV。,4、定期常规检测的目的意义,（1）流行状况：抗体水平可以准确反映猪群PRRSV的病毒循环状态，通过监测种猪群、生长猪群PRRS抗体变化的消长状况，分析是否存在PRRSV感染，在那个阶段发生感染；（2）风险评估：分析群体PRRS的状态和变化趋势，为风险预警、健康管理提供准确依据。稳定状态：血清学稳定S/P范围 0-2.0 阴性群（N：S/P 2.0 稳定活动群（SA:S/P 0-3
14、.5）不稳定活动群（UA:S/P 3.5）备注：血清学稳定S/P值范围2.0不是绝对稳定区间，不同猪场会有所不同,（3）制定策略性免疫：通过对种猪生产不同阶段、生长猪（20日龄、60日龄、90-100日龄、150-160日龄）各30份样品的PRRS抗体监测，了解PRRSV在种猪群和生长猪群的感染流行状态；种猪群30份样品检测，其中10%以上样品S/P值大于稳定区间时，可以考虑种猪实施免疫；已经免疫后的稳定种猪群，当30份检测样品阴性率大于30%时，可以考虑再次实施免疫；（4）评估疫苗干预的结果，理想的免疫状态：免疫后7天检测出现阳转；免疫后30天转阳率、抗体水平达到峰值，转阳率在80%以上，随
15、后稳定并逐步下降；被检测样品抗体S/P值处于稳定区间（S/P 2.0）；免疫理想的种猪群，所产仔猪随着母源抗体的消失，将在20日龄后开始出现阴性仔猪。,何时,如何进行猪群PRRS采样,后备母猪:检测全部或至少30-60样本/批在隔离前和隔离后,生产群,母猪(怀孕/分娩):4次/年,每次10-30样本/批,乳猪（3-4周）10-30 样本/批,断奶-保育10-30 样本/批,猪群移动是关键性的检测点,保育-肥育猪10-30 样本/批,配种公猪至少季节性监测全部公猪(原则上建议公猪不进行免疫)PRRS-Ab S/P过高或高于一定值(如2.5)的公猪暂停使用(1-2个月)或建立配种公猪PRRS阴性群
16、（S/P界定为低于0.1）母猪(怀孕/分娩)季节性监测免疫后4-6周母猪，PRRS弱毒疫苗免疫前最好检测母猪群的状态，作为是否免疫的参考PRRS-Ab S/P主要在0.4S/P2.5，CV值低于60%为免疫稳定群,5、健康管理检测方案在生产中的应用,后备母猪在引进隔离的前1-2天和隔离后进入配种群前1周,全群监测或每批10-30样本PRRS-Ab S/P2.5暂停引入繁殖群（隔离的前1-2天）S/P过高或低于0.4不进入配种群（隔离后进入配种群前1周）后备公猪在引进隔离的前1-2天和隔离后进入配种群前1周，全群监测PRRS-Ab S/P2.5暂停引入繁殖群,商品猪 免疫后4-6周，PRRS-A
17、b S/P主要在0.4-2.0监测猪群移动时：4周龄,10周龄 分析稳定状态(对于不稳定群体,延迟转群/更改免疫程序/或减少其它应激等)。不稳定商品猪群，经伤口（免疫注射，混群打斗和抗生素注射等）传播PRRSV风险最大。同时，由于母源抗体的消失，免疫系统发育不完全以及快速生长，导致对PRRSV的易感性大大增强。,三、净化PRV,伪狂犬病毒基因组结构,伪狂犬 gE、gB-养殖场PR野毒清除的黄金组合,野毒清除（PRV gE）gE 缺失疫苗免疫 gE ELISA kits 检出的阳性动物需要淘汰免疫效果评价（PRV gB）gB ELISA kits 定期监控免疫效果 只有当猪群伪狂犬感染率非常低或
18、猪群gE阴性时才 有意义，因为野毒也有gB,为什么能够净化伪狂犬病,技术上可行 高效可鉴别的疫苗 特异的gE-ELISA诊断试剂盒 费用合适,gE/gB结果的解释,PRV野毒控制策略,1.引种检测:后备公猪/后备母猪 引进时(4-6月龄)全群检测，拒绝引进PRVgE检测阳性或可疑猪只2.公猪检测:后备公猪/现役公猪 检测淘汰PRVgE阳性公猪,检测频率:2次/年3.母猪检测:怀孕母猪/产房母猪 检测淘汰PRVgE 阳性母猪,检测频率:2次/年 PRVgB 检测阴性母猪,加强免疫,检测频率:2次/年4.商品猪检测:产房乳猪/保育-育肥猪 PRVgE检测12周龄商品猪,检测频率:2次/年,PRV检测应用,检测报告实例解读,
