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1、1,第六章 微生物生态学的研究方法,2,1.直接测定法利用光学和电子显微镜对样品中的微生物进行直接观察，并计算微生物数目或测定丝状微生物的长度，其结果可以用每单位面积或每单位体积或重量的微生物数目来表示，以此来估计生物量。其优点是能够使人们直接观察到天然样品的微生物形态和微生物在自然样品所处的位置。缺点是只能取少量的样品，与微生物所生活的整个自然环境相比，少量的样品不能代表整个自然环境。,第一节 微生物生态学研究的传统方法,3,2.培养法培养微生物的方法是很多的，一般来说对所采集的样品应进行适当的稀释，以便每一个平板上只能生长有一定数目的微生物菌落。其最大优点便是可以计算自然样品中的活微生物数
2、目，并可以辨认真菌、放线菌和细菌。其缺点是造成计算误差的因素很多。比如：A.自然中的许多微生物细胞成群粘接在一起，用普通的方法很难把它们分开，这样形成的菌落可能是由许多个细胞增殖而来的，而不是由单个细胞形成的菌落.,4,B.有些微生物在平板上只能形成微菌落，不便于肉眼观察。C.一般情况下实验室所用的培养条件很难满足所有微生物的生长，所用的有限种类的培养基也无法满足所有微生物的生长。D.在平板上形成的丝状微生物菌落不知是从孢子而来的还是从菌丝而来的。尽管如此，这种方法还是被广泛用于微生物生态学研究中，特别适合用于研究细菌生态学.,5,3.生理生化法同位素示踪法。我们知道一个微生物群体的大小，那么
3、通过测定H3标记的胸腺嘧啶组入微生物群体DNA中的速率便可以估计微生物的代时。代谢活力测定法。是分析某些特殊酶类的酶活力，这一方法是假设所有待测的细胞都含有这些特殊的酶类，并且所有细胞以同样的能力使用这些酶类。,6,测定自然样品中的ATP含量也可以反映微生物代谢活力的大小和生物量的大小。测定叶绿素的含量和其他光合色素的含量可以用来估计藻类和其他光合生物的生物量和代谢活力。最广泛使用的测定代谢活力的方法是估计整个微生物群体的呼吸作用和藻类的光合作用，测定的对象是O2和CO2量的变化。,7,生理学的方法Biolog 微孔板法 Biolog GN 板是一种多底物的96 孔ELISA 反应平板。除对照
4、孔只装有四氮叠茂，其余95孔作为反应孔还装有不同的单一碳底物。在进行ELISA 反应时，各孔中的微生物利用碳底物，呼吸作用产生电子传递，引起四氮叠茂发生还原反应变为紫色。微生物对不同碳底物的利用情况可用发生反应的孔的分布及反应孔的颜色变化 时间关系即群落水平生理图谱（CLPP）来表示。通过对孔中颜色变化的光吸收值的测量，可获得较系统的信息。,8,Biolog 微孔板最初是由Biolog 公司为了鉴定纯种微生物而设计的，其碳源代谢指纹图可用来鉴定1900多种细菌、酵母和霉菌。1991 年，Garland 首次将Biolog 微孔板应用于土壤微生物群落的研究。现在Biolog 微孔板已被广泛应用于
5、描述各种环境包括土壤、淡水、沉积物、活性污泥和海水的微生物群落生理状况。,9,4.数学模型法 研究微生物生态学过程中惯用的方法，是以感官观察为基础，经过一些实验将搜集的资料加以分析和解释，并进一步归纳、假设和推理。在这过程中，其结果大多数是描述性的，数据基本是孤立的。将数学研究应用于微生物生态学研究中，以统计数据和建立生态模型来定量描述微生物生态学问题。首先在实验室中建立人工的经过简化的环境。分解成许多小的、较为简单的亚系统。这些亚系统之间的相互作用，亚系统之内各种因素的作用则用数学方程式描述。可以大大地压缩真实过程的时间、人力和物力，并在短时间内调查生态演变过程的规律，并预测生态演变过程的发
6、展趋势，提供最优利用方案。,10,第二节 微生物生态学的分子生物学研究方法,微生物分子生态学方法弥补了传统的微生物生态学方法的不足，使人们可以避开传统的分离培养过程而直接探讨自然界中微生物的种群结构及其与环境的关系。微生物生态学研究中采用的分子生物学方法主要有核酸探针技术、PCR扩增技术、rRNA序列同源性分析方法、梯度凝胶电泳方法等。,11,一、核酸探针杂交技术,核酸杂交技术快速，能灵敏地探测出环境微生物中特殊的核酸序列，并且用光密度测定法可直接比较核酸杂交所得到的阳性条带或斑点就能得出定量的结果，从而反映出相关微生物的存在及功能。其基本原理是:人工合成能与某类群微生物特征基因序列互补的寡聚
7、DNA或RNA探针，并以荧光或放射性标记该探针，然后利用该探针与微生物基因杂交，通过荧光显微镜技术或放射自显影技术对微生物的群落结构进行分析和研究。,12,核酸探针杂交法的基本的步骤：先对rRNA(基因)序列比对，并对这些序列的特异性进行鉴定，然后进行互补核酸探针的合成和标记，最后对探针的特异性和测定敏感性进行评价和优化。目前已经进行测序的核酸序列数目很有限，这样对某些生态系统中存在的微生物和核酸序列就不可能进行全面的了解，必须对各种生物的16SrRNA和23SrRNA进行测序和研究，才能设计足够的探针来监测高度可变的目标样品中的所有微生物。,13,14,寡聚核苷酸探针由人工合成，一般为30k
8、b左右，具有很高的灵敏度，可用于检测环境微生物的单一基因和点突变。目前应用较多的寡聚核苷酸探针是根据细菌rRNA基因的多拷贝且高度保守的DNA片段设计的。这种技术在微生物生态学研究时具有重要的用途：（1）用于检测环境中的微生物、指示生物及某些特定基因型的存在与否；（2）用于检测某一特定环境中的微生物种群、数量、分布及其变化，从而预测该环境中的微生物种群变化趋势；（3）用于检测某些微生物的特定基因型在环境中的动态。,15,随着基因工程技术的发展，新的核酸分子杂交技术不断出现和完善，核酸分子杂交可按作用环境大致分为固相杂交和液相杂交两种类型。固相杂交包括:组织原位杂交、菌落原位杂交、斑点杂交、So
9、uthern印迹杂交、Northern印迹杂交、固相夹心杂交、固化探针杂交、反向杂交。,16,二、PCR特异性扩增技术,PCR技术主要特点是短时间内在实验室条件下人为地控制并特异扩增目的基因或DNA片段，使研究的目的基因及其环境样品中的微量微生物基因得到无限的扩增，为这些基因和微量微生物种群的研究提供了保证。使用PCR技术可将靶序列放大几个数量级，再用探针杂交探测对被扩增序列作定性或定量研究分析微生物群体结构。,17,1、反转录PCR(RT-PCR)技术是利用反转录酶，使样品中mRNA反转录为DNA，然后利用DNA分析方法进行研究。虽然在活的微生物细胞中mRNA的含量较高，但当细胞死亡和裂解以
10、后，释放到环境中的mRNA迅速被降解。因此，RT-PCR技术常被用来分析环境样品中活体微生物生存状况和活性。,18,2、竞争性PCR曾被用来测定受多环芳香烃污染的沉降物中的编码邻苯二酚-2，3-加双氧酶的dmpB基因的浓度。对PCR扩增dmpB的基因片段进行人工改造，使其带有一个40bp大小的缺失，作为PCR扩增的竞争模板。因此，竞争模板的 PCR产物就比目的模板的PCR产物短。用竞争性PCR对二者进行共扩增，通过与竞争模板的浓度进行比较，来定量沉降物中dmpB基因的浓度。,19,3、限制性片段长度多态性技术(RFLP)是根据不同生物个体或种群之间DNA片段酶切位点有所差异的特点，利用限制性内
11、切酶进行消化，产生长短、种类、数目不同的限制性片段，然后对这些特定DNA片段的限制性内切酶产物进行分析，根据特定的限制性酶谱图可对群落中的微生物加以区分。,20,限制性片段长度多态性技术需要依赖Southern技术，需要克隆基因探针，DNA的用量较大且纯度要求很高，因此应用受到了一定限制。将PCR应用于RFLP的PCR-RFLP技术则克服了这一缺点。4、PCR-RFLP法是将PCR引物中的一条加以荧光标记，反应后用合适的限制酶切、电泳分析，再根据片断的大小不同以及标记片断种类和数量的不同分析群落的结构及组成多样性。此方法对微生物遗传多样性尤其是微生物的种以下分类具有重要意义。,21,5、随机引
12、物扩增多态性(RAPD)也是应用比较广泛的一项技术。RAPD是用那些对某一特定基因的非特异性的引物来扩增某些片段。RAPD分析用于探测含有混合微生物种群的各种生物反应器中的微生物多样性。用RAPD分析所得到的基因组指纹图谱在比较一段时间内微生物种群的变化以及比较小试规模和中试规模的反应器方面是有用的，但还不足以用来估测群落的生物多样性。,22,6、扩增片段长度多态性(AFLP)是RFLP技术和PCR技术相结合发展而成的一种新型DNA指纹图谱技术。具有可靠、有效地揭示微生物多态性水平的能力，为研究微生物属以下物种之间的亲缘关系，乃至菌株间差异提供了非常有效手段。该技术的主要步骤：（1）样品染色体
13、DNA的提取和纯化；（2）DNA的修饰和模板的制备；（3）AFLP反应；（4）聚丙烯酰胺凝胶电泳分析PCR产物；（5）放射自显影及数据的数值分析。,23,AFLP 技术与其他的DNA 指纹技术相比有其独特的优点：（1）AFLP 标记具有比RFLP、RAPD标记更为可靠、有效的揭示物种多态性水平的能力，为研究原核生物属以下物种之间的亲缘关系，乃至菌株之间关系提供了一种有效手段；（2）具有一定的灵活性，可通过特异性PCR 引物设计和内切酶组合的选择，来调整AFLP 图谱中限制性片段的适宜数目；（3）由于使用了严格的PCR条件和高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳，因而重复性好，分辨率高。,24,7、末端限
14、制性片段长度多态性(T-RFLP)，是根据16S rRNA 的保守区设计通用引物。其中一个引物的5端用荧光物质标记。提取待分析样品的总DNA，以它为摸板进行PCR扩增，所得到的PCR产物一端就带有这种荧光标记。将PCR产物用合适的限制性内切酶消化。由于在不同细菌的扩增片段内存在核苷酸序列的差异，酶切位点就会存在差异，酶切后就会产生许多不同长度的限制性片段。消化产物用自动测序仪进行检测，只有末端带荧光标记的片段能被检测到，而其他没有带荧光标记的片段则检测不到。这些末端标记的片段就可以反映微生物群落组成情况，因为不同长度的末端限制性片段必然代表不同的细菌，也就是说一种末端限制性片段至少代表一种细菌
15、。,25,T-RFLP主要应用于微生物群落组成和结构、微生物系统发育及其菌种鉴定等研究，是一种应用比较广泛的微生物生态学研究方法。该方法可降低图谱的复杂性，使结果易于分析，且重复性好，结合克隆、测序，不仅可对已知菌进行鉴定，还有助于发现新的未知菌，是细菌培养前大量筛查粪便标本菌群的有用方法。,26,8、单链构象多态性(SSCP)利用DNA片段核苷酸组成的差异，造成单链构像的不同，使单链DNA或RNA分子在电泳时产生特异性谱带。被应用于微生物鉴定、微生物区系、微生物多样性等研究领域。此法的原理是：DNA单链构象具有多态性，由于碱基序列不同而影响其空间构象，它的正常序列与变异序列的单链构象不同，因
16、此在电泳上的迁移率也不同。从而可以在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中来分析DNA单链中的基因突变。,27,其主要步骤是：（1）提取细菌基因组DNA；（2）用PCR扩增16SrDNA或16S-23SrDNA间隔区片段；（3）将特异的PCR扩增产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子；（4）该单链DNA分子进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；（5）银染或放射自显影；（6）分析得到的特异指纹图谱，与标准菌株的图谱相比较，即可分析菌群，对菌株进行鉴定。亦可对特异条带回收、测序，进行菌种鉴定和分类。,28,三、rRNA基因同源性分析方法,rRNA基因同源性分析方法是综合应用多项分子生物学技术
17、对细菌中rRNA基因进行分析，从而揭示微生物多样性。这是分子微生物生态学中最重要的方法，取得的成果也最多。rRNA在所有的微生物中，功能和进化上是同源的，同源物种之间rRNA结构是相当保守的。因此，为了确定一个分离物为一个分类单元，或证明属于一个新的分类单元，rRNA基因序列分析还是最可靠的方法。,29,rRNA序列分析技术与其它分子生物技术以及传统的纯种培养相结合，具备分析微生物多样性及其发现新物种的能力，而且提供了一种摆脱传统的纯种培养方法鉴定环境微生物的途径，并已被广泛应用于对诸如共生细菌和古细菌、趋磁细菌、海洋微型浮游生物以及土壤细菌等微生物类群的研究，并发现了众多未知的新序列。rRN
18、A方法还应用到土壤细菌的检测、基因工程菌的安全性检查、环境中微生物间的基因转移等诸多方面。但是在实际应用中，存在基因文库构建、全部序列测定周期长，工作量大，费用高等问题。,30,16SrRNA序列分析主要步骤：（1）提取基因组DNA；（2）利用16SrRNA基因两端的保守序列作为PCR的引物，PCR扩增且纯化；（3）以PCR的产物为模板直接进行16SrRNA序列分析；（4）TA克隆建库或直接测序；（5）用BLAST对所得序列进行比对分析。,31,四、变性梯度胶电泳技术,变性梯度凝胶电泳(DGGE)的原理是使用一对特异性引物，PCR扩增微生物自然群体的l6S rRNA基因，产生长度相同但序列有异
19、的DNA片段的混合物。然后用DGGE分离产物混合物DGGE方法可用于微生物群落结构的研究、微生物种群动态的分析、富集培养物及分离物的分析、核糖体RNA同源性的分析。,32,该方法扩增环境样品的16SrRNA的部分基因序列(100400bp)，通过DGGE或TGGE分离，收集不同条带的DNA测序，再同基因文库中的现有序列比较，即可确定微生物的种类。该方法的要点在于PCR引物的选择。由于扩增的环境样品成分复杂，所以研究人员都选择了核糖体小亚基的DNA的保守序列作为引物。由于电泳的限制，被分析的片断不能大于400bp。为了便于电泳的分析，提高分辨率，引物的5端有一个40bp左右的发夹结构，提高了引物
20、合成的成本。,33,34,DGGE对原水及活性污泥的分析,35,原水测序结果,多数为非培养的细菌,36,微生物生态学的困惑,PCR-DGGE 定量PCRFISH呼吸醌克隆,涌现出大量新技术,微生态系统,得到的信息仍然十分零碎而不确定,噬菌体、病毒,古细菌、细菌,原生动物,酵母、霉菌、藻,后生动物,克服了分离培养的难题,37,各种技术的特点,PCR-DGGE：便利、信息多但不确定 定量PCR：可定量、信息确定性强但少克隆：信息确定性强但工作量大基因芯片：功能强大但费用昂贵,传统培养技术,各种技术需要加强联合应用,38,相信,随着各种方法学的进一步完善,我们将会逐渐了解到自然生态环境中微生物群体多样性及实际的生存状态。,
