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1、根癌农杆菌介导2-5A合成酶基因对本氏烟的遗传转化研究,The Transformation of 2,5-oligoadenylate SynthetaseGene Mediated by Agrobacterium tumefaciens in N.benthamina,前 言,烟草病毒病是烟草生产中危害最大的病害，其发生遍及各烟区，它们不仅造成烟草产量的损失，而且使烟草品质严重下降，近年来田间经常出现的病毒粒子复合侵染现象，更加重了病毒病对烟株生长的危害，使病毒症状加重且表现复杂化。耕作制度的变迁，持续暖冬现象的发生和北方保护地蔬菜面积的不断扩大，造成了有利于病毒和其它毒介体越冬越夏的环
2、境条件，使烟草病毒病有日趋严重之势。,自1988年以来，为提高我国烟草的抗病、抗虫和烟叶质量，我国开始开展转基因烟草研究。转基因烟草是通过植物基因工程技术将编码特殊性状的外源基因构建到植物表达载体上，通过生物、物理或化学等方法，导入到受体烟草细胞或组织中，然后由受体细胞或组织再生得到的烟草植株及其后代。,当前，转基因烟草研究主要集中在以下领域：(1)改善烟草的抗病、抗虫、抗逆和抗除草剂等农艺性状；(2)提高烟草的品质，降低烟草的有害成分；(3)利用转基因烟草生产生物制品；(4)利用转基因烟草进行基因功能研究。,由于烟草具有操作容易、培养基配方简单、组织培养周期短和转化效率高等优点，所以其实进行
3、转基因的模式植物之一。通过遗传工程选择抗病毒的品种是防治烟草病毒病的一个重要途径，对于减少农药，保护环境更有深远的意义。世界上的科技工作者对此方面进行深入研究，并且获取明显成果。,1957年,英国科学家Alick lsaacs和Lean Lindenmann利用鸡胚绒毛尿囊研究流感干扰现象时，发现一种能够干扰病毒繁殖的物质,称之为干扰素(interferon，IFN)。IFN是细胞和机体受到病毒感染，或者受核酸、细菌内毒素、促细胞分裂素等作用后，由受体细胞分泌的一种广谱抗病毒糖蛋白。,它的产生和作用的发挥受细胞基因组的调控，其活性表现为重要的免疫调节功能，抑制病毒活性。干扰素的作用机制研究表明
4、,它并非直接作为反式作用因子对其效应分子的基因组进行调控,而是借助受体介导的信号转导系统引发一系列特异的生化反应,直至达到调控效应分子的目的.,一般认为干扰素诱导细胞产生抗病毒作用主要是2-5A系统在发挥重要作用。2-5A系统主要由两种酶组成：2,5-寡腺苷酸合成酶（2,5-oligoadenylat synthetase）和内切核糖核酸酶(RNaseL)。,在双链RNA存在时，2,5-寡腺苷酸合成酶被激活，以细胞中的ATP和单链RNA为底物，合成一种特殊结构，激活RNaseL从而降解病毒RNA，阻止病毒复制，达到抗病毒的目的。由于单链RNA病毒的生命周期中都有双链RNA的中间体，因此，利用该
5、基因有可能达到广谱抗病毒目的。,据此，Truve等将一种来自大鼠的2,5-寡腺苷酸合成酶cDNA通过农杆菌导入马铃薯。结果表明，在大田条件下，转基因马铃薯叶子和块茎中马铃薯X病毒（PVX）的浓度要低于表达该病毒外壳蛋白的转基因植株。人体干扰素（HuIFN）能在某些植物中诱导对病毒的抗性。,Orchansky等（1982）发现HuIFN能降低TMV对Samsun烟叶碟和原生质体的侵染。Rosenberg等（1985）也证实HuIFN能抑制不同品种的烟草原生质体中TMV的增殖。Sela及其同事（1982）在普通烟-TMV系统中发现基因工程的HuIFN具有同天然HuIFN相类似的效应。Vicent等
6、（1987）报道，除HuIFN外，HuIFN也能显著地抑制TMV对曼佗罗的侵染。,自从20世纪70年代末世界上产生第一例转基因植物以来，转基因技术发展迅速，产生了许多植物遗传转化方法，目前常用的转基因方法有两种：农杆菌介导转化法和基因枪法。农杆菌介导法是利用根癌农杆菌中的Ti质粒进行遗传转化。,农杆菌介导法有以下几个优点：（1）技术简单，不需大型仪器设备；（2）对受体要求不严格，原生质体、愈伤、器官、组织均可；(3)转化周期短、遗传稳定性好、拷贝数少。农杆菌介导法转化双子叶植物特别有效，在众多的双子叶植物中，烟草已成为转基因研究的模式植物，已获得了各种用途的转基因烟草，而且有很多已进入大田实验
7、10。,本实验根据2-5A基因和RNaseL基因在抗病毒中起关键作用的原理，将构建好的2-5A基因植物表达载体通过根癌农杆菌的侵染对本氏烟进行遗传转化，以期获得对病毒有抗性的转基因烟草，并为进一步的研究提供实验材料。,1 实验材料和方法,1.1实验材料已构建好的载体pBINplusA（载体具有抗Kan基因），土壤农杆菌LBA4404，本氏烟（N.benthamina）河南农科院植物保护研究所提供,1.2酶和试剂,DNA/EcoR+Hind marker、；X-gal、IPTG、DEPC、PCR试剂盒、DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒购自上海生工。Taq DNA聚合酶、dNTP购自Takara公司
8、。卡那霉素(Kan)，头孢先锋霉素（Ce）、利福霉素（Rif）、丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基磺酸钠(SDS)等购自上海生工。6-苄基嘌呤（6BA）、吲哚乙酸（IAA）其它常用试剂为国产分析纯。,1.3培养基LB培养基：酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L,调pH至7.0。MS基本培养基：大量元素、微量元素、有机元素、铁盐。共培养基：MS1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IAA(pH7.0),1.4 实验方法 实验流程为,1.4.1pBINplusA转化农杆LBA4404（1）感受态细胞制备 挑取单菌落LBA4404接种于2mL LB液体培养基（
9、含50mg/ml Rif）中，28振荡培养过夜。取过夜培养菌液1ml接种于50mL LB中，28 振荡培养至OD500为0.5左右，5000rpm离心5min，弃上清，加入10ml 0.15M NaCl，悬浮细胞，5000rpm离心5 min，弃上清，加入1 ml冰冷的20mM CaCl2,，置冰浴中24h内使用。,（2）农杆菌的转化植物表达载体pBINplusA冻融法直接转化农杆菌LBA4404。取200l感受态细胞LBA4404，加入1g植物表达载体PBINplusA，冰浴30 min，液氮中冻1min，再加入到1mL LB培养基，28振荡培养4h，1000rpm离心30s，加入0.1ml
10、 LB培养液悬浮细胞，涂布含有Kan(100mg/L)和Rif(125 mg/L)的LB固体平板上，28培养2天。,（3）阳性选择 分别随机挑选4个克隆，菌落PCR鉴定。（4）保存 固体平板培养基上于4下保存数月或15%甘油中-70长期保存。,1.4.2无菌苗的获得（1）将烟草种子用细密纱布包裹，用清水冲洗（2）无菌条件下，将镊子在酒精灯上方烧三次，再将烟种置于事先灭过菌的三角瓶中（3）70乙醇浸泡包有纱布的种子30s，再用升汞溶液消毒2min,（4）菌水冲洗5次后将纱布打开，将种子置于已经消毒的培养皿中的吸水纸上（5）稍风干后均匀点播于1/2 MS固体培养基上（6）25暗培养3天（7）于25
11、光照强度6000lux及光照时间16h/d条件下培养。,1.4.3外源基因对烟草的转化及再生（1）菌液制备 将含有植物表达载体PBINplusA的土壤农杆菌LBA4404接种于50mL LB培养液（Kan 100mg/L，Rif 125mg/L）中，28,150rpm摇菌过夜培养至OD600 为0.51.0。,（2）外植体的制备将温室生长的本氏烟无菌苗幼嫩叶片剪下，用自来水冲洗干净后，经70%乙醇消毒1min，15%次氯酸钠消毒3min，灭菌水洗涤34次，灭菌滤纸吸干后备用。将长至六周的无菌苗取出(叶片2-3cm)，在无菌操作条件下，选幼嫩叶片剪下置于培养皿中备用,（3）转化及植株再生根据Ho
12、rsch等的叶盘法转化。步骤（2）中的外植体去掉叶缘及大叶脉，将叶片剪成0.51cm2见方的小叶盘投入预先准备好的农杆菌菌液中，室温下不断摇动1015min后取出叶片，用滤纸吸干子叶盘表面菌液，置于铺有一层滤纸的MS培养基上,25-28在黑暗条件下共培养48h将外植体转移到MS分化培养基上继续培养(16h光照/d，25-28)分化培养基：MS1 mg/L 6-BA 0.1 mg/L IAA+50mg/L Kan+400 mg/L Ce(pH5.8),使用头孢氨卡（400 mg/L）抑菌，卡那霉素（50mg/L）进行抗性筛选。,2结果分析,2.1转化PCR检测植物表达载体pBINplusA冻融法
13、直接转化农杆菌LBA4404，涂布含有Kan(100mg/L)和Rif(125 mg/L)的LB固体平板上，28培养2天。培养两天后形成大量菌落，挑选4个菌落进行PCR检测，检测结果见图一,1 2 3 4 5,图一：转化体PCR检测结果,泳道1,2,4,5 为 pBINplusA的条带，pBINplusA基因大小为18.4kb，检测引物是按照2-5A基因设计的，扩出的片段为1.2kb；泳道3为DNA/EcoR+Hind marker。结果表明挑出的4个菌落均为阳性克隆,即pBINplusA已成功转入到根癌农杆菌中。,2.2无菌苗的获得将本氏烟种子在无菌条件下，使用70乙醇浸泡30s，升汞溶液消
14、毒2min，无菌水冲洗5次，稍风干后均匀点播于1/2 MS固体培养基上，25暗培养3天后，于25光照强度6000lux及光照时间16h/d条件下培养。6周后获得叶盘为2-3cm的所需烟草无菌苗（见图二）。,图二：经无菌操作得到的烟草无菌苗,2.3 根癌农杆菌介导的烟草叶片的遗传转化及转基因植株的再生将在三角瓶内生长六周左右的无菌苗，将其叶片切成小叶盘，浸入摇好的含有植物表达载体PBINplusA的土壤农杆菌LBA4404菌液中，1015min后取出叶片，用滤纸吸干多余菌液，共有111片外植体，转入共培养基MS1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IAA(pH7.0)上暗培养48h。,然后转
15、入含有50mg/L Kan+400 mg/L Ce(pH5.8)的分化培养基上（Ce抑菌，Kan筛选抗性再生植株），诱导愈伤组织产生，每15d换一次培养基，对于中途污染褐变的外植体要立即取出，在无菌条件下将同一培养皿中未污染的转移到另一新培养皿。,在分化培养基上培养15d左右，产生了愈伤组织，以后愈伤组织逐渐变绿，20d后从愈伤组织上分化出不定芽；30天后有57个外植体诱导产生出了愈伤组织，其中有30个分化出了不定芽（见表一，图三）。,表一：外植体愈伤分化情况,注：愈伤组织的诱导率%=愈伤组织的诱导数/外植体数。不定芽分化率%=不定芽分化数/愈伤组织的诱导数。,a b c,图三：由叶盘转化法得
16、到的烟草叶片愈伤组织及分化出的不定芽,（a:15天后诱导出现愈伤组织；b:20天后愈伤组织继续分化；c:30天后分化出的不定芽）,由表一可以看出，我们获得了有抗性的愈伤组织，并在筛选培养基上分化出了不定芽；图三表明，可能目标基因已经转化，还需进一步进行检测验证是否就是转基因烟草。,3讨论,3.1叶片的取材叶片取材相当容易，但是转化要选用健壮而较幼嫩的叶片（长至2-3cm为宜），若叶片太嫩，则在农杆菌侵染后叶片就会脱水；若叶片太老，农杆菌侵染后叶片就会失去活力。在接种叶片时，要把叶片的正面贴在培养基上，因为这样观察到这样放置的再生效果较好。,3.2影响农杆菌转化的因素转化体的选择是遗传转化过程中
17、一个重要步骤，一般采用适当的选择剂进行筛选，被转化的细胞能在含有选择剂的培养基上生长和分化，而未被转化的细胞则被抑制和杀死。一定要选用合适的选择剂浓度，选择能全部抑制或杀死外植体的最小(临界)浓度作为选择剂的最适浓度。,在农杆菌转化植物细胞时,本实验采用头孢霉素抑制农杆菌生长,卡那霉素用以筛选。对于卡那霉素所选的作用浓度为50ug/ml，如果其浓度过小，在筛选抗性植株时就会出现较多的假阳性植株；如果浓度过大，就会抑制转基因植株的再生。选用头孢霉素的作用浓度为400ug/ml,它可以抑制根癌农杆菌的过度繁殖，因此浓度也要适量。然而，对于烟草来说，由于影响转化效果的因素还很多，例如，植物的基因型、
18、农杆菌菌株以及农杆菌与外植体共培养的条件等。,在农杆菌介导的遗传转化过程中，农杆菌作为一个独立体系直接影响到转化频率的高低。在农杆菌快速的生长过程中常常会出现质粒丢失、基因突变。因此，不但要选择培养基上进行划线培养获得单一菌落。取单一菌落进行悬浮培养，在合适的时机与植物细胞或组织混合共培养，其余的菌落可在固体平板培养基上于4下保存数月或15%甘油中-70长期保存。利用对数生长期的农杆菌进行保存、筛选、繁殖和转化最为有效。,农杆菌的浓度也会影响转化效率，在对农杆菌的稀释过程中发现，农杆菌浓度过高，会对叶片造成污染，致使叶片死亡，而浓度过低，农杆菌进入植物体的数目减少，转化的成功率会降低。温度与转
19、速同样也会影响转化效率，若温度过高，可能会引起质粒丢失，而温度过低，农杆菌生长缓慢。同样转速低于250r/min，农杆菌生长到对数生长期时间就长。,农杆菌叶盘直接浸泡法进行外源基因转化时,感染后共培养时间的长短会影响转化效率，如果太短，外源DNA还来不及整合到植物DNA中，而时间过长，根癌农杆菌过度生长，又会损坏植物细胞造成再生困难。不同的烟草品种在整个转基因的过程中所需的时间不一样，这与不同的烟草品种的生长周期有关。,通常共培养时间为2d.而在实验中发现不能完全依赖天数来确定培养的最佳时间.菌液浓度、温度、植物材料的不同,结果可能也会完全不同,有时培养2d后,外植株已被菌包埋,有时2d后未见
20、菌落,此时转入选择培养基很难获抗性愈伤,芽的再生频率极低(5%).这可能是农杆菌的过度生长导致外植体的养分供应困难,而造成再生困难;菌与外植体有效接触时间过短外源基因尚未整合到植物基因组中之故。,对于影响转化效率的因素，本实验还可继续进行研究其他条件对于转化的影响，如农杆菌侵染叶片的时间长短，培养时间、温度、光照以及培养基内抗生素含量等，这些因素都可能对植株的再生产生影响。再者，为了提高实验效果还可以在稀释后的农杆菌培养液中加入乙酰丁香酮，这样可以增加菌株的侵染活力。有人报道如果在转化前把植物组织与乙酰丁香酮共培养34个小时效果会更好。,本实验选用了转基因模式植物本氏烟，培养基、激素浓度、抗生素及其浓度的选择都是用了经验数据。已经初步筛选获得抗性愈伤组织与再生芽，下一步的工作是将不定芽切下接种于含Kan的MS生根培养基上培养，诱导生根至获得完整的抗性植株，然后进行PCR检测验证是否为转基因植株；,进一步的工作是将黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草花叶病毒（TMV）等植物病毒对转基因植株进行侵染实验，检测植株对病毒的抗性变化，进而验证目的基因的表达，如果该转基因烟草品种能够成功培育获得，并具有对植物病毒的广谱抗性，在保证安全性的前提下，将有望在较大程度上提高烟草的产量和质量，在烟草转基因研究领域也有着重大的理论和实践意义！,
