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1、第七章 蛋白质和氨基酸的测定,第一节 概述1.蛋白质是生命的物质基础 是构成细胞的组成成分：细胞膜中的蛋白质，线粒体、内质网等细胞器上的结构蛋白或酶，染色体中的核蛋白，血液中的血红蛋白，也是激素和抗体的基本成分。2.担当重要的生理功能 是生物体发育及修补组织时所需氨基酸的来源;物质代谢的生物催化剂;营养物质及气体的运输;遗传信息的传递与表达;人体内的组织液pH（健康pH在7.37.5之间）及水分的平衡;为免疫系统制造对抗细菌和感染的抗体；一般认为成人每人每天营养需要量为：75克蛋白质。,3.蛋白质的组成及特性,蛋白质的组成:蛋白质由很多的AA单体以肽键结合而成的具有一定空间结构的含氮有机化合物
2、，有的含有P、S、Cu、Fe、I等元素，分子量高达数万数百万。含氮是蛋白质区别于其它有机化合物的主要标志。蛋白质系数：一般而言，蛋白质含氮量约为16%，即1份氮相当于6.25份蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白质系数。氨基酸的种类:自然界中已经发现的氨基酸约有170多种，其中组成蛋白的氨基酸只有22种（都是-AA），其中对人而言的必需氨基酸有8种（犬的必需氨基酸有9种）。组成蛋白的氨基酸（-AA）的通式及AA两性电解质特性：,5.优质蛋白质（对人类而言）,必需氨基酸：在组成蛋白的氨基酸中，在人体内不能合成或合成速度很慢的氨基酸。对人类而言,优质蛋白质的定义:蛋白质中必需氨基酸的含量高,且总体氨
3、基酸的组成比例接近母乳蛋白氨基酸比例的蛋白质。动物来源和豆类食品是很好的优质蛋白质。一般而言：动物性蛋白所含必需氨基酸的种类及数量较多,而植物性蛋白所含必需氨基酸的种类及数量较少。,6.常用的蛋白质和氨基酸的测定方法,蛋白质含量测定最常用的方法是凯氏定氮法，准确、操作较费时，在国内外应用普遍。双缩脲法、染料结合法、酚试剂法等也常用于蛋白质含量测定，由于方法简便快速，故多用于生产单位质量控制分析。另外，国外采用近红外分析仪，利用波长在0.753m范围内的近红外线具有被蛋白质组分吸收及反射的特性，建立了近红外光谱快速定量方法。在一般的常规检验中多进行氨基酸总量的测定，通常采用酸碱滴定法来完成。,第
4、二节 蛋白质的定性测定,一、蛋白质的一般显色反应电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并变色。书中列举了常用染料。二、复合蛋白质的显色反应（一）糖蛋白的显色（3种方法）（二）脂蛋白的显色（2种方法）,考马斯亮蓝法(Stain with Coomassie blue)：考马斯亮蓝法灵敏度比氨基黑高五倍，尤其适用于SDS电泳的微量蛋白质的染色。在549nm有最大吸收值，蛋白质在110g呈线性关系。可以检测出0.1 ug 的蛋白质条带.但银染法可以检测出 2 ng的蛋白质条带.,第三节 蛋白质的定量测定一、凯氏定氮法（包括常量与微量）凯氏定氮法是先测定总氮量,然后乘以蛋白质换算系数，即可得到粗蛋白质
5、含量。可用于所有动、植物食品的蛋白质含量测定。但因样品中常含有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物，故结果称为粗蛋白质含量。凯氏定氮法由Kieldahl于1833年首先提出，经过长期改进，迄今已演变成常量法、微量法、自动定氮仪法、半微量法及改良凯氏法等多种，至今仍被作为标准检验方法。在此主要介绍常量凯氏定氮法的原理及步骤。,1.原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化成二氧化碳和水逸出，而部分硫酸被还原成二氧化硫，样品中的有机氮转化为氨与过量的硫酸结合成硫酸铵;然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用弱酸硼酸吸收后再以标准强酸如盐酸或硫酸溶液滴定，根据
6、标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。,催化剂煮沸,1、消化：蛋白质+浓H2SO4（NH4）2SO4+CO2+SO2+H2O 2、氨化：2NaOH+（NH4）2SO4 2NH3+Na2SO4+2H2O 3、吸收:2NH3+4H3BO3（NH4）2B4O7+5H2O 4、滴定：（NH4）2B4O7+5H2O+2HCl 2NH4Cl+4H3BO3(注:不同指示剂的颜色变化不同),凯氏定氮法原理（方程式）,2.操作步骤,准确称取样品0.50-2.00g500ml凯氏瓶中加10g无水K2SO4加0.5gCuSO4加20mLH2SO4通风橱中先以小火加热，待泡沫消失后，加大火力，消化至透明无黑粒后（不时转动
7、消化瓶使粘附于瓶壁上的样品溶于消化液中）继续消化30分钟至到样液呈绿色，停止消化，冷却。将消化好并冷却至室温的消化溶液全部转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。,向接收瓶内加入10mL4%硼酸溶液和12滴混合指示剂。将接收瓶置于蒸馏装置的冷凝管下口，使下口浸入硼酸溶液中。取100.05mL稀释定容后的试液，沿小玻璃杯移入反应室，并用少量蒸馏水冲洗小玻璃杯，一并移入反应室。塞紧棒状玻璃塞，向小玻璃杯内加入约10mL40%氢氧化钠溶液。提起玻璃塞，使氢氧化钠溶液缓慢流入反应室，立即塞紧玻璃塞，并在小玻璃杯中加水，使之密封。蒸馏5min。降低接收瓶的位置，使冷凝管管口离开液面，继续蒸馏
8、1min。用少量蒸馏水冲洗冷凝管管口，洗液并入接收瓶内。取下接收瓶。,用0.1mol/L（或0.05mol/L）盐酸标准滴定溶液滴定收集液至刚刚出现紫红色为终点。同一试样做两次平行试验，同时做空白试验。蛋白质的含氮量一般为 15%17.6%，有的上下浮动,可以测出总氮.N/16%=N6.25=蛋白质含量,（1）硫酸钾：作为增温剂，提高溶液沸点，纯硫酸沸点 330，加入硫酸钾之后可以提高至400以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。（2）硫酸铜：作为催化剂。还可以作消化终点指示剂（做蒸馏时碱性指示剂）。硒粉、氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、二氧化钛都为催化剂，但为了防止污染通常
9、采用硫酸铜。(3)40%NaOH的作用,各种试剂的作用,影响氨化完全和速度的因素（1）K氏烧瓶和取样量 如果称1g以上的样品，就需要K氏烧瓶最小500ml，8001000ml的更好，这样的K氏烧瓶对于缩短氨化时间，加热的均匀性和完全氨化效果最好。,（2）分解剂 H2SO4和K2SO4的添加量 有机物分解需要H2SO4量，应根据有机物种类不同而加的量就不同，如果试样含脂类高，则加H2SO4多，为了提高分解温度，要大量添加K2SO4，但不能太多，也不能太少，太少则氨化不充分。K2SO4和H2SO4的添加比例是：1g样品 K2SO4：H2SO4=7g：12mL 这种比例在国内外都使用，是公认的 还有
10、一种比例：K2SO4：H2SO4=10g：20mL,催化剂 用作催化剂的有Hg、HgO、Se，硒化合物，CuSO4、TiO2。Hg，HgO有毒但结果好，Se与CuSO4得到结果是一种，用TiO2的结果偏低，采用不同的催化剂则消化时间不同，所以在给出测定结果时要注明催化剂的类型。,（3）热源的强度 消化时热源的强度同迅速消化和完全氨化关系很大，即便盐类K2SO4加得多，如果热源弱，也是没有意义的，热源过强导致H2SO4损失，使氨回收率低。,说明及注意事项所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘附在凯氏瓶内壁上的含氮化合物未消化完全而造成氮损失。消化过程中应注意不时
11、转动凯氏烧瓶，将附在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全。,样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30%过氧化氢23mL后再继续加热消化。若取样量较大，如干试样超过5g，可按每克试样5mL的比例增加硫酸用量。,一般消化至呈透明后，继续消化30min即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色
12、。蒸馏装置不能漏气。蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。,硼酸吸收液的温度不应超过40，否则对氨的吸收作用减弱而造成损失，此时可置于冷水浴中使用。(11)蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1min后关掉热源，否则可能造成吸收液倒吸。(12)向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀物。这是由于分解促进剂与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀。,二、紫外吸收法 1.原理：利用蛋白质的特有基团，,对280nm处紫外光有吸收作用，吸光度与蛋白质浓度成直线关系，求含量。,2适用范围：常用于生物化学工作，因为干扰因素多，故在
13、食品分析领域应用不广泛。3主要仪器：紫外分光光度计 离心机（3000 5000 r/min）4操作：用凯氏法测定标样做标准曲线,第四节 氨基酸的分析,什么是氨基酸?氨基酸的分类氨基酸的化学结构?氨基酸的两性电解质的特性,氨基酸的结构,一、氨基酸的一般定量测定（一）甲醛滴定法 氨基酸具有酸性的-COOH基和碱性的-NH2基。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH2基与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用标准强碱溶液来滴定-COOH基，并用间接的方法测定氨基酸总量。反应式如下：,1操作方法 吸取含氨基酸约20mg的样品溶液于100mL容量瓶中，加水至标线，混匀后吸取20
14、.0mL置于200mL烧杯中，加水60mL，开动磁力搅拌器，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液mL数，供计算总酸含量。加入10.0mL甲醛溶液，混匀。再用上述氢氧化钠标准溶液继续滴定至pH9.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液毫升数(V1)。同时取80mL蒸馏水置于另一200mL洁净烧瓶中，先用氢氧化钠标准溶液调至pH8.2，（此时不计碱消耗量），再加入10.0mL中性甲醛溶液，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至pH9.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液毫升数(V2),作为试剂空白试验。,2结果计算 氨基酸态氮质量分数（%）=f(V1-V2)式
15、中：V1样品稀释液在加入甲醛后滴定至pH9.2时所消耗氢氧化钠溶液的体积；V2空白试验加入甲醛后滴定至pH9.2时所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积,3.说明（1）本法准确快速，可用于各类样品游离氨基酸含量测定。（2）浑浊和色深样液可不经处理而直接测定。（3）在发酵工业中常用此法测定发酵液中氨基氮含量的变化，来了解可被微生物利用的氮源的量及利用情况，并以此作为控制发酵生产的指标之一。（4）脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使结果偏低；酪氨酸含有酚羧基，滴定时也会消耗一些碱而致使结果偏高；溶液中若有铵存在也可与甲醛反应，往往使结果偏高。,第五节 氨基酸的分离及测定,一、薄层色谱法1原理取一定量经
16、水解的样品溶液，滴在制好的薄层板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用，同一物质具有相同的Rf值，不同成分则有不同的Rf值，因而各种氨基酸可达到彼此分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，即可鉴别样品中所含氨基酸的种类，从显色斑点颜色的深浅可大致确定其含量。,D1,D2,A,B,C,如何进行TLC刮样法分离氨基酸,2D TLC,二、氨基酸自动分析仪法1原理氨基酸的组分分析，现在广泛地采用离子交换法，并由自动化的仪器来完成。其原理是利用各种氨基酸的酸碱性、极性和分子量大小不同等性质，使用阳离子交换树脂在色谱柱上进行分离。当样液加入色
17、谱柱顶端后，采用不同的pH值和离子浓度的缓冲溶液即可将它们依次洗脱下来，即先是酸性氨基酸和极性较大的氨基酸，其次是非极性的芳香性氨基酸，最后是碱性氨基酸；摩尔质量小的比摩尔质量大的先被洗脱下来，洗脱下来的氨基酸可用茚三酮显色，从而定量各种氨基酸。定量测定的依据是氨基酸和茚三酮反应生成蓝紫色化合物（570nm）的颜色深浅与各有关氨基酸的含量成正比。但脯氨酸和羟脯氨酸则生成黄棕色化合物（440nm），故需在另外波长处定量测定。,氨基酸自动分析仪3操作方法 样品处理：测定样品中各种游离氨基酸含量，可以除去脂肪杂质后，直接上柱进行分析；测定蛋白质的氨基酸组成时样品必须经酸水解（称取干燥的蛋白质样品数毫
18、克，加入2mL5.7mol/L盐酸，置于110烘箱内水解24h，然后除去过量的盐酸，加缓冲溶液稀释到一定体积，摇匀），使蛋白质完全变成氨基酸后才能上柱进行分析。如果样品中含有糖和淀粉、脂肪、核酸、无机盐等杂质，必须将样品预先除去杂质后再进行酸水解处理。去杂质的方法如下：去糖和淀粉：把样品用淀粉酶水解，然后用乙醇溶液洗涤，得蛋白质沉淀物。去脂肪：先把干燥的样品经研碎后用丙酮或乙醚等有机溶剂离心或过滤抽提，得蛋白质沉淀物。去核酸：将样品在100g/L氯化钠溶液中，85加热6h，然后用热水洗涤，过滤后将固形物用丙酮干燥即可。去无机盐：样品经水解后含有大量无机盐时还必须用阳离子交换树脂进行去盐处理。,
19、样品分析：经过处理后的样品上柱进行分析。上柱的样品量根据所用自动分析仪的灵敏度来确定。一般为每种氨基酸0.1mol左右（水解样品干重为0.3mg左右）。测定必须在pH55.5、100下进行，反应进行时间为1015min，生成的紫色物质在570nm波长下进行比色测定。而生成的黄色化合物在440nm波长下进行比色测定。*显色反应用的茚三酮试剂，随着时间推移发色率会降低，故在较长时间测样过程中应随时采用已知浓度的氨基酸标准溶液上柱测定以检验其变化情况。*采用反相色谱原理制造的氨基酸分析仪，可使蛋白质水解出的17种氨基酸在12min内完成分离，且具有灵敏度高（最小检出量可达1pmol）、重现性好以及一
20、机多用等优点。,1.高效液相色谱法适于分析沸点高、分子量大、热稳定性差的物质和生物活性物质。2.由于大多数氨基酸无紫外吸收及荧光发射特性，而紫外吸收检测器和荧光检测器是HPLC仪的最常的检测器。故人们需将氨基酸进行衍生化，使其可以利用紫外吸收或荧光检测器进行测定。3.氨基酸的衍生可分为柱前衍生和柱后衍生。柱后衍生需额外的反应器和泵，常用于氨基酸自动分析仪，如前文所提的茚三酮反应。4.在氨基酸的HPLC测定中，更多的还是采用柱前衍生法，这是因为比起柱后衍生法它的优点有：（1）固定相采用C18(反相色谱)，可分辨分子结构细小的差异；（2）流动相为极性溶剂，如甲醇、乙二腈等，避免对荧光检测的干扰，可提高灵敏度及速度；（3）一机多用。,AAs assay by HPLC,思考题：1.试述蛋白质测定中，样品消化过程所必须注意的事项，消化过程中内容物颜色发生什么变化？为什么？2.样品经消化进行蒸馏前，为什么要加入氢氧化钠？这时溶液发生什么变化？为什么？如果没有变化，说明什么问题？须采用什么措施？3.硫酸铜及硫酸钾在测定中起了什么作用？4.试述氨基酸态氮的测定原理。5.结果计算中为什么要乘上蛋白质系数？,观察与思考：1、样品中加入浓硫酸后，溶液的颜色立即发生什么变化？2、消化过程中是否有大量的泡冲到瓶颈，原因是什么？3、瓶颈有什么颜色的有毒烟产生？4、如何判断消化的终点？,
