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1、实验1大肠杆菌的培养和分离,实验目的：,1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。2.进行大肠杆菌的分离，用固体平面培养基本进行细菌的划线培养。3.说明大肠杆菌培养的条件和实验原理。,微生物包括哪五类：,病毒细菌放线菌真菌原生动物,特点：结构简单,形体微小.通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构.且体内一般不含有叶绿素.不能进行光合作用.,原核生物界,原生生物界,真菌界,病毒界,一、基础知识：(一)微生物,细菌的外形与大小,细菌：单细胞不分枝的原核微生物。细菌细胞微小而透明，通常用适当染料染色后显微镜观察,图1-1 常见的三种细菌典型形态A.球菌 B.杆菌
2、 C.弧菌,细菌细胞由外向里依次有鞭毛、菌（纤）毛、荚膜、细胞壁、细胞膜、细胞质，细胞质中又有液泡、储存性颗粒、核质等。,细菌的构造,*细胞壁,结构特点：坚韧且有弹性细胞壁有哪些功能？固定细胞外形；,保护细胞免受外力的损伤；,阻拦大分子物质进人细胞；,使细胞具有致病性及对噬菌体的敏感性。,伤寒杆菌细胞壁中含毒素,芽孢,有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌.,菌落：,单个
3、或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。菌落是鉴定菌种的重要依据。,细菌的菌落特征因种而异,细菌的营养类型,根据细菌所利用的能源和碳源的不同，将细菌分为两大营养类型。1.自养菌:2.异养菌:腐生菌 寄生菌 大部分病原菌,光合自养型:光合细菌化能自养型:硝化细菌,铁细菌,硫细菌,放线菌,1、结构：单细胞原核分支状的菌丝（基内菌丝、气生菌丝）,链霉素、土霉素、四环素、氯霉素、红霉素、庆大霉素,微生物中发现了几千种抗生素，其中2/3是由放线菌产生的,应用:,病毒的结构,病毒的增殖：,（二）培养基,培养基（培养液）是由人工方法配制而成的，专供
4、微生物生长繁殖使用的混合营养液。,（1）按物理状态分：固体培养基和液体培养基、半固体培养基。固体培养基用于菌种保存及分离、鉴定菌落、活菌计数等，半固体培养基可观察微生物的运动，液体培养基常用于发酵工业。（2）按功能分：选择培养基和鉴别培养基。（3）按成分分：天然培养基和合成培养基。,1.培养基的类型和用途,液体培养基：,表面生长,均匀混浊生长,沉淀生长,固体培养基：菌落，菌苔,半固体培养基：,无动力 有动力(弥散),(是否运动),选 择 培 养 基,加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基:分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基:分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基:分
5、离自养型微生物加入青霉素等抗生素的培养基:分离导入了目的基因的受体细胞加入氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培养基:分离杂交瘤细胞,2.不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方(参考教材附录内容),3.不管哪种培养基，一般都含有水、碳源和氮源、无机盐等营养物质，另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质,例如:生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。,培养基内所含的基本物质,(1)水(2)碳源(3)氮源(4)无机盐,(2)碳源,可作为碳源的物质有:含碳无机物:、含碳有机物：,蛋白质,脂肪酸,不同微生物所利用的碳源
6、不同异养型微生物的碳源为自养型微生物的碳源为,碳酸盐,碳酸氢盐,二氧化碳,糖类（主要）,含碳有机物（有机碳）,含碳无机物（无机碳）,(3)氮源,可作为氮源的物质有:含氮无机物：、含氮有机物：,蛋白胨,牛肉膏,尿素,固氮微生物所利用的氮源是,氮气,氨气,硝酸盐,氨盐,氮气,培养基内所需的其他条件,(1)pH值如:培养霉菌需酸性、培养细菌需中性或微碱性(2)特殊营养物质-?如：培养乳酸杆菌需要在培养基中添加维生素(3)氧气的含量如:培养厌氧微生物时需要提供无氧的条件(4)渗透压,生长因子,(三)无菌技术,1、获得纯净培养物的关键:2、无菌技术 的四个方面(参看教材20页),防止外来杂菌的入侵,无菌
7、技术的四个方面,（1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；（2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；（3）为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近旁进行；（4）避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。,3、消毒与灭菌(1)消毒：概念：使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物。包括芽孢和孢子吗？方法:煮沸消毒法巴氏消毒法:如牛奶的消毒化学药剂消毒:酒精、氯气、石碳酸、煤酚皂溶液等紫外线消毒,(不包括芽孢和孢子),（2）灭菌,概念：使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。方法：a 灼烧灭菌 b 干热灭菌 c 高压蒸汽
8、灭菌,灼烧灭菌,微生物的接种工具(接种环、接种针)或其他金属用具直接在火焰的充分燃烧层灼烧,注意适用范围,配制培养基,包器材,灭菌,菌种扩增,倒平板,接种、划线,培养,观察记录,实验流程,实验流程,配制培养基,包器材,灭菌,菌种扩增,倒平板,接种、划线,培养,观察记录,1计算、称量2溶化3调pH：pH764过滤：这一步可以省去。5分装：分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。6加塞7包扎,操作步骤,配制培养基,LB固体培养基,市场常见琼脂条,配制培养基,包器材,灭菌,菌种扩增,倒平板,接种、划线,培养,观察记录,实验流
9、程,包器材,包器材,配制培养基,包器材,灭菌,菌种扩增,倒平板,接种、划线,培养,观察记录,实验流程,条件：121、100kPa20-30min,灭菌,接种前准备,用肥皂洗手并使用酒精消毒。顺序：点燃酒精灯酒精棉擦拭双手酒精棉擦拭桌面,配制培养基,包器材,灭菌,菌种扩增,倒平板,接种、划线,培养,观察记录,实验流程,菌种扩增,接种扩大培养：靠近酒精灯火焰将大肠杆菌接种到三角烧瓶的液体培养基中，三角烧瓶在37摇床振荡培养12h。,菌种扩增实验用具,LB固体培养基大肠杆菌菌液（LB液体培养基）培养皿接种环酒精棉酒精灯镊子、火柴、记号笔,菌种扩增,摇床震荡培养12h（于LB液体培养基中）,本图来自十
10、一学校,配制培养基,包器材,灭菌,菌种扩增,倒平板,接种、划线,培养,观察记录,实验流程,配制培养基,包器材,灭菌,菌种扩增,倒平板,接种、划线,培养,观察记录,实验流程,倒平板,配制培养基,包器材,灭菌,菌种扩增,倒平板,接种、划线,培养,观察记录,实验流程,接种、划线,灼烧接种环取菌液划线分离,烧至暗红,接种、划线,灼烧接种环取菌液划线分离,菌液膜,接种、划线,平板划线的操作方法交叉划线法连续划线法,划线分离,为什么通过划线分离可得到单菌落？每划完一个区域要不要灼烧接种环？,倒置后做好标记，写在培养皿侧面,划线分离,6、培养,为什么要倒置培养？,恒温37培养,菌种的保存,1、临时保藏：接种
11、到固体斜面培养基，菌落长成后置于4冰箱保存。2、长期保存：甘油冷冻管藏法,问题讨论,1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,答：以免
12、接种环温度太高，杀死菌种。,3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,问题讨论,涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？,应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。,平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,平板划线时不能划破培养基的原因?,一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。,
