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1、ABI Stepone plus荧光定量PCR仪操作规程一、创建新实验使用 StepOne 软件中的 Design Wizard （设计向导）创建新实验。1. 双击（StepOne 软件快捷键），或依次选择 Start （开始） All Programs（所有程序） Applied Biosystems StepOne StepOne v2.0。2. 从 Home （主页）屏幕上，单击 Design Wizard （设计向导）以打开Design Wizard （设计向导）屏幕。二、定义实验属性1. 单击 Experiment Name （实验名称）字段，然后输入 Comparative CT
2、Example （比较 CT 示例）。注意： 实验标题会以您输入的实验名更新。2. 单击 Barcode （条码）字段，然后输入您的 PCR 反应板上的条码。3. 单击 User Name （用户名）字段，然后输入 Example User （示例用户）。4. 单击 Comments （注释）字段，然后输入 Comparative CT Getting Started Guide Example （比较 CT 入门指南示例）。5. 选择 Quantitation （定量）实验类型。6. 单击 Next （下一步）。三、定义方法和材料1. 选择 Comparative CT (CT) （比较 C
3、T (CT)）作为定量方法。2. 为试剂选择 TaqMan Reagents（TaqMan 试剂）或SYBR Green Reagents（SYBR Green 试剂）。3. 将 Standard （标准）选为升降温速度。4. 为模板类型选择 cDNA (complementary DNA) （cDNA （互补 DNA）。5. 单击 Next （下一步）。四、设置Targets1. 单击 How many targets do you want to quantify in the reaction plate? （您想在反应板中定量多少靶？）字段，然后输入 2。2. 设置靶 1 检测：a.
4、单击 Enter Target Name （输入靶名称）单元格，然后输入 TP53。b. 从 Reporter （报告基团）下拉菜单中，选择 FAM （默认）或SYBR。c. 从 Quencher （淬灭基团）下拉菜单中，选择 NFQ-MGB （默认）或 None。d. 保留 Color （颜色）字段中的默认设置。3. 设置靶 2 检测：a. 单击 Enter Target Name （输入靶名称）单元格，然后输入 GAPDH。b. 从 Reporter （报告基团）下拉菜单中，选择 FAM （默认）或SYBR。c. 从 Quencher （淬灭基团）下拉菜单中，选择 NFQ-MGB （默认）
5、或 None。d. 保留 Color （颜色）字段中的默认设置。4. 单击 Next （下一步）。五、设置Samples1. 单击 How many samples do you want to test in the reaction plate? （您想在反应板中检测多少样本？）字段，然后输入 2。2. 单击 How many replicates do you need? （您需要多少次重复反应？）字段，然后输入3。3. 设置样本 1：a. 单击 Enter Sample Name （输入样本名）字段，然后输入 Liver （肝脏）。b. 保留 Color （颜色）字段中的默认设置。4.
6、 设置样本 2：a. 单击 Enter Sample Name （输入样本名）字段，然后输入 Brain （脑）。b. 保留 Color （颜色）字段中的默认设置。5. 在 View Plate Layout （查看反应板布局）选项卡上，从 Arrange Plate by （反应板布局方式）下拉菜单中，选择 Rows （按行）（默认）。6. 单击 Next （下一步）。六、设置相对定量设置在比较 CT 示例实验中： 脑用作对照样本。 GAPDH 用作内对照。1. 从 Which sample do you want to use as the reference sample? （您想将哪个
7、样本用作对照样本？）下拉菜单中，选择 Brain （脑）。2. 从 Which target do you want to use as the endogenous control?（您想将哪个靶用作内对照？）下拉菜单中，选择 GAPDH。3. 单击 Next （下一步）。七、设置运行方法1. 单击 Graphical View （图形视图）选项卡（默认）或 Tabular View （表格视图）选项卡。2. 确保 Reaction Volume Per Well （每个反应孔的反应体积）字段中显示20L。3. 确保温度变化过程设置显示如下所示的保持和循环阶段。4. 单击 Next （下一步）。八、完成 Design Wizard （设计向导）工作流程1. 在 Review Plate for Experiment （查看实验的反应板）窗口中，查看反应板布局。2. 单击 Save Experiment （保存实验）。3. 在 Save Experiment （保存实验）对话框中，单击 Save （保存）以接受默认文件名和位置。
