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1、,第四章 核酸操作基本技术,第一节 核酸的提取与纯化,第二节 核酸的检测与保存,第三节 核酸凝胶电泳,第四节 核酸分子杂交,第一节 核酸的提取与纯化,第一部分：DNA提取方法简介,第二部分：DNA提取常见问题、原因分析及其对策,第三部分：RNA提取方法简介,第四部分：RNA提取及其RT-PCR常见 问题、原因分析及其对策,核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作。,前言,如何快速、高效的提取高质量的核酸是基因工程成功与否的第一步！,第一部分：DNA提取方法简介,DNA提取的几种方法,基因组DNA的提取,C
2、TAB法 SDS法 其它,非基因组DNA的提取,质粒DNA的提取,碱裂解法 煮沸法,线粒体、叶绿体DNA的提取,差速离心结合SDS裂解法,基因组DNA CTAB法,CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）,CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。,注：CTAB溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心
3、时温度不要低于15。,CTAB提取缓冲液的经典配方,Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA(乙二胺四乙酸)螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNP(脱氧核糖核蛋白)充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除；,CTAB提取缓冲液的改进配方,PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。,CTAB法流程图,植物材料,裂解液,上层溶
4、液,液氮研磨,抽提,细胞裂解,干燥溶解,离心洗涤,酒精沉淀,DNA溶液,基因组DNASDS法,SDS法原理,SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（5565）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提高盐(KAC或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提（变形蛋白质），反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。,SDS法DNA提取缓冲液,SDS法流程图（以动物组织为例）,基因组DNA其它方法,根据细胞裂解方式的不同有：,物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法生物方式：酶法,根据核酸分离纯化
5、方式的不同有：,吸附材料结合法：,硅质材料阴离子交换树脂磁珠,高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。特点：快捷高效。,低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。特点：高纯度,磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。特点：低成本,基因组DNA其它方法,浓盐法（生化试验做过）：有机溶剂抽提法：密度梯度离心法：,利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离,有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用,利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物,质粒DNA碱裂解法,碱裂解法原理,染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒D
6、NA为共价闭合环状分子；当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。,碱裂解法流程图,菌体,溶液III中和,溶液I充分重悬,溶液II裂解,上清液,抽提,离心洗涤,酒精沉淀,干燥溶解,沉淀,质粒DNA溶液,质粒DNA煮沸法,煮沸法原理,染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA
7、在冷却时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。,细胞器DNA差速离心法,线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。,差速离心法原理,是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离。,第二部分 DNA提取常见问题、原因分析及其对策,DNA提取
8、的基本步骤,I.材料准备II.破碎细胞或包膜内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或水中,材料准备,最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集,基因组DNA的提取,质粒DNA的提取,使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量菌株不要频繁转接（质粒丢失）,细胞裂解,材料应适量，过多会影响裂解
9、，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶K细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡,基因组DNA的提取,质粒DNA的提取,菌体量适当培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮变性的时间不要过长（5分钟），否则质粒易被打断复性时间也不宜过长，否则会有基因组DNA的污染G菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁,核酸分离、纯化,采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系；采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔；离心分离两相时，应保证一定的转速和时间；针对不同材料的特点
10、，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法；,基因组DNA的提取,质粒DNA的提取,蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等）高盐洗涤蛋白酶处理,多酚的去除：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合,盐离子的去除：70的乙醇洗涤,多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。用PEG
11、8000代替乙醇沉淀DNA：在500L DNA液中加入200l 20%PEG8000(含1.2 M NaCl)，冰浴20min。,杂质的去除,核酸沉淀、溶解,当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasepH值为8.0，可防止DNA发生酸解,基因组DNA的提取,质粒DNA的提取,DNA提取常见问题,问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应
12、。,DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应DNA中残留有金属离子,重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）重新沉淀DNA，让酒精充分挥发增加70乙醇洗涤的次数（2-3次）,原因,对策,问题二：DNA降解。,材料不新鲜或反复冻融未很好抑制内源核酸酶的活性提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断外源核酸酶污染反复冻融,尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌将D
13、NA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融,对策,原因,问题三：DNA提取量少。,实验材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗涤时DNA丢失,尽量选用新鲜（幼嫩）的材料动植物要匀浆研磨充分；G菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）低温沉淀，延长沉淀时间加辅助物，促进沉淀洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒,对策,原因,第三部分：RNA提取方法简介,RNA提取的通用方法,异硫氰酸胍/苯酚法,原理：细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体
14、系中的中间相和水相，从而得以分离；有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。,步骤:材料准备：尽量新鲜。裂解变性：异硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶。纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。洗涤：70乙醇。沉淀：异丙醇、无水乙醇。乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，沉淀RNA。此外还常用氯化锂选择沉淀RNA。,材料：新鲜，切忌使用反复冻融的材料如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在TRIzol或样品贮存液中，于-70或-20保存；如要多次提取，请分成多份保存；液氮长期保存，-
15、70短期保存；,样品破碎及裂解：根据不同材料选择不同的处理方法：培养细胞：通常可直接加裂解液裂解酵母和细菌：一般TRIzol可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻样品量适当，保证充分裂解为减少DNA污染，可适当加大裂解液的用量,纯化：在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；经典的纯化方法，如 LiCl 沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成 RNA 降解；柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响 RNA 后续酶反应的杂质，是目前较为理想的选择。,RNA提取常见问题,RNA 的降解 OD260/
16、OD280 比值偏低 电泳带型异常 下游实验效果不佳,RNA降解,新鲜细胞或组织：裂解液的质量外源RNase的污染裂解液的用量不足组织裂解不充分另外某些富含内源酶的样品(如脾脏，胸腺等)，很难避免 RNA 的降解。建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。,冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70冰箱保存。样品要相对小一点；先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。,OD260/OD280 比值偏低,蛋白质污染：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。减少起始样品
17、量，确保裂解完全、彻底解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。苯酚残留：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。,抽提试剂残留：确保洗涤时要彻底悬浮 RNA，并且彻底去掉 75%乙醇。解决办法:再沉淀一次后，溶解。设备限制：测定OD260 及OD280 数值时，要使OD260 读数在 0.10-0.50 之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测 OD 时，对照及样品稀释液请使用 10 mM Tris，pH 7.5。用水作为稀释液将导致比值的降低。,电泳带型异常,非变性电泳：上样量超过 3ug，电压超过 6V/cm，电泳缓冲
18、液陈旧，均可能导致 28S 和 18S 条带分不开。变性电泳条带变淡：EB 与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些；甲醛的质量不高。,此外，非变性电泳中，可观察到28S和18S的同分异构体。,下游实验效果不佳,RNA 降解 抽提试剂的残留 75%乙醇洗涤 样品中杂质的残留 多糖等杂质，再次沉淀 DNA 污染 使用RNase-Free 的 DNase I 消化抽提RNA,RT常见问题分析和解决方案,问题一：少量或没有RT-PCR产物,可能原因,解决方案,问题二：有非特异性带,引物和模板的非特异性退火 基因特异性引物设计较差 RNA中有基因组DNA的污染 形成引物二
19、聚体 镁离子浓度太高,提高反应的温度和特异性 提高引物的特异性 使用扩增级DNase处理RNA 设计在3端没有互补序列的引物 优化镁离子浓度,可能原因,解决方案,问题三：产生弥散（smear）条带,第一链产物的含量过高 PCR反应中引物过多 循环数过多 退火温度过低 寡核苷酸片段产生的非特异性扩增,常规PCR步骤中减少第一链产物的量减少引物的用量 减少PCR的循环次数 提高退火温度 提取高质量RNA，防止被DNA污染,可能原因,解决方案,第二节 核酸的检测与保存,核酸的检测,核酸样品的浓度的测定，一般采用紫外光谱分析、荧光分析、水平式琼脂糖凝胶电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法和脉冲电泳法等。,一.
20、紫外光谱分析法,紫外光谱分析法的原理基于DNA(或RNA)分子在260nmm处有特异的紫外吸收峰且吸收强度与系统中DNA或RNA的浓度成正比。分子形状、双链与单链之间的转换也会导致吸收水平的改变，但是这种偏差可以用特定的公式来校正。该法的特点是准确、简便，但所需仪器较昂贵。,衡量所提取DNA的纯度可用OD260与OD280的比值,OD260/OD280对DNA而言其值大约为1.8。衡量所提取RNA的纯度也可用OD260与OD280的比值,OD260/OD280对RNA而言其值大约为2.0。纯DNA：OD260/OD2801.8(1.9，表明有RNA污染；1.6，表明有蛋白质、酚等污染）纯RNA
21、：1.7 OD260/OD2802.0（1.7时表明有蛋白质或酚污染；2.0时表明可能有异硫氰酸残存）,二.EB荧光分析法,EB荧光染料能插入DNA或RNA的碱基对平面之间并结合在上面，在紫外光的激发下产生桔黄色荧光。由于结合于DNA分子之上的EB的量与DNA分子长度和数量成正比，则荧光强度可以表示DNA量的多少。,EB,Green View,核酸的保存,影响保存的关键因素1、保存液的pH值 过酸或过碱均可能使氢键解离，导致核酸不稳定。2、保存温度 温度升高会增加核酸的分子内能，对维持核酸结构的稳定性不利。,正是由于核酸的保存存在困难，因此我们一般直接保存材料本身（-20或-70）或者是将获得
22、的目的基因片段通过克隆保存在宿主菌中。,第三节 核酸的凝胶电泳,基本原理一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。就是说，电场强度越大，电泳分子所携带的净电荷数量越多,其迁移的速度越快,反之则较慢。电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳迁移率。,DNA分子在凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖一磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，
23、即DNA分子本身的大小和构型。？,不同构像质粒,电泳技术优点：快速、准确、重现性好电泳分类 按电场分：常压（500V，适用小分子）支持体分：自由电泳、区带电泳 仪器装置分：水平式、垂直式、悬架式电泳条件：水溶液（缓冲液）、支持物（区带电泳）、电场（电泳仪、电泳槽）,一.DNA琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖为链状多糖 绳状琼脂糖束大网孔型 凝胶 分离、鉴定、纯化DNA影响DNA迁移率的因素：DNA分子的大小、构 象，凝胶浓度，电压，电泳缓冲液的组成缓冲液pHDNA Pi，DNA带负电荷，迁移率与 分子量对数成反比DNA分子构象影响迁移率：共价闭环DNA线 状DNA开环DNA,不同浓度琼脂糖分离DNA分子的范围,琼脂糖浓度（%）分离范围（kb）0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-4 2.0 0.1-3,电泳器材,电泳槽结构,操作步骤,琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，EB凝胶板的制备：加梳子，倒胶样品的制备：样品+1/5体积溴酚蓝加样：加样端为负极（黑）电泳：5V/cm or 9V/cm观察：紫外灯下观察，照相,溶胶,准备胶槽,铺胶,凝胶凝固后取出梳子,加缓冲液,准备样品,点样,电泳,注意观察溴酚蓝染液的迁移,紫外灯下观察电泳结果,照相,
