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1、GraphPad Prism 5. 0应用软件计算药物的EC50童， 白喜云， 解晓晶， 李宏全*于( 山西农业大学动物科技学院，山西 晋中 030801)摘要 通过一个实例，系统介绍如何应用 GraphPad Prism 5 0 软件计算药物的体外 EC : 将经试验获得的某抗50病毒药物对病毒感染所致细胞病变的抑制率数据输入 GraphPad Prism 5 0 ，设置参数，即可自动拟合量效曲线， 生成并输出相关参数值和量效关系图表，给出 EC50 值。关键词 GraphPad Prism 5. 0 ; 量效曲线; EC50中图分类号文献标志码文章编号1001 5094( 2012) 04
2、 0180 04TP 319BCalculation of in Vitro EC50 of a Drug by GraphPad Prism 5 0 SoftwareYU Tong， BAI Xi-yun，XIE Xiao-jing，LI Hong-quan( School of Animal Science and Veterinary Medicine， Shanxi Agricultural University， Jinzhong 030801，China)AbstractGraphPad Prism 5 0 software used for the calculation of
3、in vitro EC of a drug was intro-50duced through an example: the fitted dose-effect curve and EC50 value were generated and outputted auto- matically following the inputting of inhibition rate data of an antiviral drug on virus-induced cytopathic effect and the setting of parameters in GraphPad Prism
4、 5 0 GraphPad Prism 5. 0 ; dose-effect curve; ECKey words50行了更合理细致的分类3。GraphPad Prism 5. 0 软药物的量效关系分析是药效评价中的基本分析之一，是以药效实验所得数据为基础而对药物作 用进行科学评价的一种方法。药物的量效关系反 映了药效作用的剂量依赖性，因而可为药物使用剂件在计算 EC50 方面比人工绘图读点法更精确、快捷并可重现，它能根据量效 关 系 方 程: Y = Bottom +( Top-Bottom ) / ( 1 + 10 ( ( LogEC50 X ) *量的确定提供依据1。半数有效浓度( EC
5、 ) 是指HillSlope) ) ，对数据进行拟合，直接得到量效曲线50在药效实验中药物对相应症状产生 50 % 最大效应 时的浓度，为药效评价中的重要指标，其分析方法也 属药物的量效关系分析范畴2。现行的 EC50 计算方法，根据原理可分为两类: 一类是绘制曲线读点法，另一类是几率单位加权回 归法。本文则介绍应用 GraphPad Prism 5. 0 软件和 EC50 。与其他统计学软件相比，该软件在使用过程中无需人工对数据进行标准化或加权回归，能真实再现实测值，操作简便，结果直观、全面、准确，可广泛用于药物的 量 效 关 系 研 究 及 量 效 曲 线 的绘制。1 原始数据采集与处理计
6、算 EC50 的方法。GraphPad Prism 5. 0 软件是由GraphPad Software 公司开发的基础生物统计及绘图综合软件，于 2007 年 8 月推出，其对生物统计方法进将 2 倍连续稀释的某抗病毒药物溶液分别加入载有被病毒感染细胞的细胞培养板培养孔( 简称药接受日期 2011-10-21项目资助 山西省科技攻关项目( No. 2010311047)* 通讯作者:李宏全，教授;研究方向:中药调节动物免疫功能及其分子机制;Tel: 0354-6289568;E-mail: livets 163. com物实验孔) ，同时设置未加药液的含有被病毒感染细胞对照孔( 简称病毒对照
7、孔) 和未被病毒感染细 胞对照孔( 简称细胞对照孔) ，并置 37 的 CO2 培 养箱中培养，直至病毒对照孔中的细胞病变率达到80 % 左右时，用 MTT 试剂对各孔细胞进行染色，经DMSO 显色处理后，用酶标仪测得各孔细胞光密度 ( OD) 值( 见表 1) 。表 1 MTT 法所测各孔细胞 OD 值OD values of cells in culture holes by MTT assayTable 1不同质量浓度药物实验孔( gL 1 )重复序号细胞对照孔病毒对照孔1. 000 000. 500 000. 250 000. 125 000. 062 500. 031 2512345
8、60. 8520. 8110. 9040. 8080. 8850. 9060. 2750. 2640. 2710. 2710. 1630. 2790. 7600. 7960. 7410. 8630. 8210. 7640. 6520. 7260. 6240. 6960. 7100. 6330. 4640. 4650. 4600. 4840. 5410. 5080. 4050. 3270. 4400. 3730. 3600. 3930. 4150. 3440. 2840. 3570. 2880. 3800. 4120. 3230. 3940. 2980. 3580. 354求算病毒对照孔和细胞对
9、照孔的平均 OD 值，并分别将各质量浓度药物实验孔的 OD 值代入公式 计算细胞病变抑制率: 抑制率 = ( 药物实验孔 OD 病毒对照孔平均 OD) / ( 细胞对照孔平均 OD 病毒对照孔平均 OD) 100 %4，结果见表 2。表 2 各药物实验孔的细胞病变抑制率Table 2 Inhibition rates on cytopathic effect in cell culture holes with different drug concentrations不同质量浓度( gL 1 ) 药物实验孔的细胞病变抑制率 / %细胞对照孔平均 OD病毒对照孔平均 OD重复序号1. 000
10、000. 500 000. 250 000. 125 000. 062 500. 031 251234560. 8610. 25489. 380. 210093. 484. 083. 477. 861. 072. 875. 162. 565. 634. 834. 038. 047. 341. 934. 612. 130. 719. 617. 522. 924. 914. 94. 9717. 05. 6320. 826. 511. 123. 17. 2717. 216. 526. 1差( SD)( plot Mean and Error with SD) ，以自动计算2 图表新建平均值和标准差;
11、 单击“新建( Create) ”按钮开始图表的制作和 EC50 的计算。3 数据输入GraphPad Prism 5. 0 启动后，自动打开欢迎界面，点击“新表格 图表( New table Graph) : ”功 能项中的“XY”选项，进入坐标图的设置，其中，“样品数据( Sample data) ”选项组中选择“打开空白表格( Start with an empty data table) ”; “选择图表类型 ( Choose a graph) ”选项组中选择最左侧的散点图; “重复与误差值数据列( Subcolumns for replicates or error values)
12、”设 置 为: 不 选 择“自 变 量 误 差 线 ( X error bar) ”，Y 选项选择“平行数据列中输入6 次重选择并复制表 2 中的细胞病变抑制率数据，在GraphPad Prism 5. 0 表格中按鼠标右键将其转置粘 贴( Paste Transpose，Paste Data) 到空白的“Data Table1”中，随即 GraphPad Prism 5. 0 便将“Data Table 1”中的数据直接转换成 Graphs 表单中的图表，此时，点击“Graphs”选项树下的“Data 1”即得到对应数据的散点图( 见图 1) 。复 值 ( Enter 6replicate
13、values in side-by-side sub-colums) ”，并以均值和误差作图，误差值设置为标准“Results”表 单 中 自 动 生 成 ( 见 图 4 ) ，其 中，“LoEC50”即为对应 X 轴的读值4，由于表格中输入X 值为浓度值，因 此 “Log EC50 ”即 是 所 求 的EC50 值。图 1 细胞病变抑制率线性坐标散点图Figure 1 Scatterplot in linear axis for inhibition rates on cyto- pathic effect4 参数设置图 3 拟合的细胞病变抑制率曲线Figure 3 Fitted curve
14、 of inhibition rates on cytopathic effect在线性浓度坐标 X 轴中，以倍数稀释的浓度并非均匀的分布，因此要对图表的格式进行重新设定。 双击 X 轴进入 X 轴格式设置: 以 2 倍稀释为例，将 “X 轴 刻 度 ( Scale ) ”确 定 为“Log 2”，“数 据 格 式( Number format ) ”修 改 为“Power of 2 ”，随 后 设 置 Y 轴的“数值范围( Range) ”为“0-100”并确认，即得 到趋势明显的散点图( 见图 2) 。图 4 输出结果截图Figure 4 Listed output results2 讨论
15、采用曲线读点法计算 EC50 ，是通过手工绘制作图或利用统计学软件拟合量效曲线，进而确定量效曲线的基线位置( Baseline ) 和最大效应位置图 2 细胞病变抑制率对数坐标散点图Figure 2 Scatterplot in logarithmic axis for inhibition rates on cytopathic effect( EMAX ) ，在基线和最大效应值平均值处作 X 轴平行线，与量效曲线相交，再自交点作 X 轴垂线，其在5与 X 轴上的截距即为 EC50 值 。该方法的优点是完全遵循量效曲线的走势，但因手工作图易出现5 曲线拟合及 EC50 计算单击“分析工具栏(
16、 Analyses) ”中的曲线拟合工 具，选择“Dose-response-Stimulation ”选项中的“Logagonistvs. response-Variable slope”，随后“设置数 值限制 ( Constrain ) ”中的限定“下 限 ( Bottom ) ”和 “上限( Top) ”分别为“大于 0 ”和“小于 100 ”，单击 “OK”确认，接着对图表和曲线进行修饰，即得曲线 图( 见 图 3 ) 。 同 时，量 效分析的全部结果也在 偏差以及以指数为坐标的 X 轴为非线性轴，手工作图读点法所得结果仅仅是一个接近真实结果的估测值; 此外，常用统计学软件在拟合 EC
17、 曲线和读点50过程中也存在诸多不便，如无法同时获得 EC50 和曲线。而另一种目前较常用的 EC50 计算方法是几率单位加权回归法，如经典的 Bliss 法或以 Bliss 法为原理开发的工具或软件，其将反应率转化为几率单位，并予以数学纠正，再进行加权回归，得出校正后2，6-7的线性方程，从而计算出 EC50 。此方法的优点是能够得到校正线性方程，且可带入数据进行运算， 编程的几率单位法工具还可使计算过程简单化，而 处理过程需要加权回归，并不能完全再现实测结果， 其结果也仅是接近 EC50 真实值的估计值。此外，以 往处理药效实验数据的方法大多存在着各种不便， 如陈俊秀等7 早期采用的计算器
18、编程法，操作繁 琐，对操作者的经验要求高，总步骤达 38 步之多，且 数据处理过程中的错误和结果的偏差不易发现。而 应用GraphPad Prism 5. 0 软件处理药物的量效关 系数据并计算 EC50 时，步骤简单，可直接复制常见 文档中的数据，且处理过程中的图表和数据直观明 晰，有效避免了错误的发生。其中，在数据输入设置 上，可根据数据处理要求，选择不同的数值，包括平 均值、中位数或每个重复值，而误差自动计算功能可 选择标准差、标准误、95 % 置信区间和实际数据范 围进行计算和表示。在原理上，该方法与经典的量效曲线绘制和读点法相一致，曲线的拟合绘制符 合统计学规律，读点无需估计，结果准
19、确，并能够直 接输出。在结果输出上，除了文中截取的关键数据 和结果外，该软件还可直接输出计算结果的标准差、95 % 置信区间及曲线的拟合优度，并同时得到能够 复制到常用文档中的量效曲线图。熟练操作的情 况下，该方法的整个处理过程仅需约 0. 5 min 即可 完成，比周一平6介绍的软件处理过程更简单。可 见，此法简捷、易操作，能够胜任大批量药物筛选时 的数据处理，是较为理想的 EC50 计算工具。如同本文所举实例，在实验数据的处理过程中， 常会遇到量效曲线的基线位置并不位于 X 轴、最大反应值也不位于 100 % 反应率位置的情况。对此，一般处理方法是，将数据标准化，使其在 Y 轴方向伸展 以
20、尽量充满整个图表。而 GraphPad Prism 5. 0 的处理方法为，直接运算并重新定义 Top 值和 Bottom 值，无需人工对数据进行标准化。因为数据的标准化程度不同，所得 EC50 值可能会出现误差，并不一定 与 Y 为 50 % 时所对应的药物浓度相一致。 而经GraphPad Prism 5. 0 处理数据后所得 EC 则定义为50Y 是 Top 值和 Bottom 值的平均值时所对应的药物 浓度，如果在数据处理时将曲线标准化到 Bottom 值 为 0 及 Top 值为 100 % 时，EC50 就是曲线上 Y 为50 % 时所对应 X 轴上的浓度值3。参考文献1刘昌孝，孙
21、瑞元 药物评价实验设计与统计学基础M 北京: 军事医学科学出版社，2001: 1-11. 赵斌，葛金芳，朱娟娟，等 小议在 MTT 法测细胞增殖 抑制率 中 IC50 的 计 算 方 法J 安 徽 医 药，2007，11( 9) : 834-836.Motulsky H J GraphPad Prism Version 5 0 StatisticsGuideM San Diego: GraphPad Software，inc ，2007.Li SY，Chen C，Zhang HQ，et al Identification of natural compounds with antiviral
22、activities against SARS-associat- ed coronavirusJ Antiviral Res，2005，67( 1) : 18-23. 李晶晶，杨璞，叶方立 一种简单、精确计算 EC50 的方法J 数理医药学杂志，2001，14( 6) : 481-482.23456周一平 用 SPSS 软件计算新药的 LD50J 药学进展，2003，27( 5) : 314-316.陈俊秀，王甲东 Bliss 法半数量电子计算器程序运算 法J 中国药理学通报，1986，2( 1) : 62-65.7櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄
23、櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄简讯减肥复方产品 Qnexa 在美国申请上市关键词 Qnexa; 托吡酯; 芬特明; 减肥; 先天畸形中图分类号R 971Vivus 公司最近再次向美国 FDA 递交了减肥复方产品 Qnexa( 芬特明 + 托吡酯) 的新药申请( NDA) ，并缩小了其应用范围，即仅用于肥胖的男性和无生育能力的女性。此前由于本品中活性成分托吡酯可能导致新生儿先天缺陷( 包括唇裂) ，本 品未获 FDA 批准。此次为配合 FDA 的审批，应 FDA 要求，该公司正在开展一项名为 FORTRESS 的回顾性考察研究，旨在 评价孕妇服用托吡酯后可能引起新生儿严重先天畸形和唇裂的风险，其结果有望于 2012 年 3 季度公布。先前一项类似于 FORTRESS 的小型研究显示，托吡酯等抗癫痫药并无致畸作用，即在生育前 10 个月内服用托吡酯的 孕妇其新生儿先天畸形或唇裂发生率并未较未服用托吡酯的对照组孕妇显著提高。因此，Vivus 公司总裁 Peter Tan 称，不 排除 Qnexa 获准后用于育龄妇女的可能。本品申报的适应证包括身体质量指数( BMI) 大于 27 kgm 2 的肥胖症患者和肥 胖引起的高血压、2 型糖尿病、血脂代谢障碍或向心性肥胖( 即腹部肥胖) 患者。( 范鸣 编译)
