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1、一、样品的浓缩 在生物活性物质的提取和精制过程中，常常需要通过蒸发将发酵滤液或提取液进一步浓缩，提高其活性物浓度，以利于后一工序的操作，由于各种料液特性不同，因此，需要采用不同的蒸发浓缩方法来进行。蒸发的方式有自然蒸发和沸腾蒸发：自然蒸发是溶液中溶剂在低于沸点下气化，溶剂的气化仅发生在溶液的表面，蒸发速度缓慢。沸腾蒸发是使溶液中的溶剂在沸点时气化，溶剂的气化不仅发生在溶液的表面，而且发生在溶液内部，蒸发速率远远超过自然蒸发速率，工业上的蒸发大多采用沸腾蒸发。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,蒸发具有以下特点：1、蒸发的物料是溶有不挥发性溶质的溶液。当加热蒸气温度一定时，蒸发溶液时的传热温度差要比
2、蒸发纯溶剂时为小，溶液的浓度越大，这种影响越显著。2、蒸发要气化大量的溶剂，因此需要耗大量的加热蒸汽。3、被蒸发的溶液本身常具有某些特性，如某些热敏性材料在高温下易分解变质，可采用减压蒸发，有些溶液则有较大的粘度或较强的腐蚀性等。蒸发操作可在常压、加压或减压条件下进行，由于大多数蛋白质、酶、抗生素、糖都是热敏性物质，为了减少它们在蒸发浓缩时的破坏，应尽量降低浓缩的温度和缩短时间，故多采用真空条件下的浓缩。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,常用的浓缩方法 1、聚乙二醇法：将待浓缩液放入透析袋内，袋外覆以聚乙二醇，袋内的水分很快被袋外的聚乙二醇所吸收，在极短时间内，可以浓缩几十倍至上百倍。2、超滤浓
3、缩：根据溶质分子和悬浮粒子是否通过多孔膜来进行筛分。在液压驱动下，能通过超滤膜的分离粒子的范围，一般为0.001-0.01m（或分子量下限）。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,3、减压浓缩：溶液在减压下加热使溶剂气化而浓缩的操作方法，称为减压浓缩，即通常所指的真空浓缩。真空浓缩的基本原理是降低液面压力，使液体沸点相应降低，真空度越高沸点也就越低，所需浓缩的时间比常压浓缩要短，加热时温度亦相应地降低，且有利于被浓缩的溶液中的有效成分不受破坏，加快了浓缩的过程。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,4、薄膜蒸发浓缩：薄膜蒸发浓缩是指使液体形成薄膜后蒸发，变成浓溶液。成膜的液体具有极大的气化表面，热传导快，
4、均匀，没有液体静压的影响，能较好地防止物料的过热现象，可避免药物受热时间过长。5、反渗透：以高分子透过性薄膜为分离介质，在超过溶液渗透压力下，使溶液中的溶剂透过薄膜，同时使溶质和不溶物阻截在膜前。这一过程类似于渗透，但方向相反，即溶剂从浓度高的溶液一侧传递到浓度低的一侧，故称反渗透。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,二、样品的干燥 干燥是使物质从固体或半固体状态除去水分或他种溶剂，从而获得干燥物品的过程。干燥的主要目的有：提高药物或药剂的稳定性，提高药物质量；有利于保存运输；使药物或药剂达到一定的规格标准；便于进一步处理。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,第四章 多糖样品的干燥,（一）干燥原理 干
5、燥指采用气化的方法以除去物料中的水分（或溶剂）的操作过程。平衡水分和自由水分：物料每单位重量中所含水分的总量称为总水分（或湿含量）。在普通的干燥条件下，不能将总水分全部除去，必有一部分的水分成平衡状态存在于物料中，这部分不能除去的水分称为平衡水分。平衡水分的大小与物料的性质和空气的状态（空气的相对湿度及温度）有关。总水分和平衡水分之差称为自由水分，自由水分能在干燥过程中被除去。,干燥速度及影响干燥速度的因素：干燥速度是指在单位时间内单位面积上被干燥的物料中水分的气化量。在干燥过程中，水分先从物料的内部扩散到表面，然后气化转移到气相中，所以干燥速度取决于物料内部扩散和表面气化的速度，干燥速度通常
6、由实验测出，影响干燥速度的因素，主要有下列4个方面：,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,1、物料的性质：这是影响干燥速度的主要因素，有些物料在干燥过程中的后阶段，由于表面气化速度大于内部扩散速度，物料表面因迅速干燥而引起结块或龟裂现象，为防止这种现象，必须采取一些降低表面气化速度的措施。有些物料在干燥过程中其表面气化速度总是小于内部扩散速度，此时干燥速度被表面气化过程所控制，所以增加表面气化速度可提高干燥速度。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,2、干燥介质的性质和流速：（1）干燥介质的流速：空气的流速越大，则干燥速度越大，因为提高空气的流速可以降低表面气化的阻力，从而提高干燥速度。（2）干燥介质的温
7、度：在适当温度范围内，提高空气的温度可提高干燥速度，因为提高空气温度后相应地提高了物料表面的温度使物料表面气化速度加快，但提高温度时需要考虑到物料的热稳定性能。（3）干燥介质的相对湿度：空气的相对湿度越低，则干燥速度越快，因为空气湿度越低，物料平衡水分数值越小，被干燥除去的自由水分相应增加，有利于物料干燥后水分的降低。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,3、干燥介质与被干燥物料的接触情况：物料堆放在干燥器内静止不动，将大大增加干燥所需要的时间，若使物料悬浮于干燥介质中促使物料彼此分开而不停地跳动，可大大改善干燥的效率，喷雾干燥及气流干燥等就是根据这一原理进行的。4、压力：干燥室内压力的大小与物料气
8、化速度成反比，真空干燥的应用就是为了降低干燥室的压力，使物料的水分（或溶剂）在低于常压的温度下就能很快的气化，从而加快干燥的速度。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,（二）常用的干燥方法1、有机溶剂法：醇析 95%乙醇 无水乙醇 无水 乙醚 置有P2O5、NaOH真空干燥。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,2、冷冻干燥 是在低温低压条件下，将物料中的水分直接升华的一种干燥方法。升华：从水在不同压力下物态变化的相图可知，在三相点以上的压力和温度下，水可以由固态冰变为液项水最后变成水蒸气。而在三相点（三相点的温度为0.0098压力为0.61kPa）以下的压力和温度下，冰可以由固相不经过液相直接变为蒸气，
9、水蒸气遇冷后，仍变为固相冰，这个过程就是升华。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,例如：冰的蒸气压在-40时为13.3Pa，在-60时为1.33Pa，若将-40冰面上的压力降低到1.33Pa，则水即从故态的冰直接变成水蒸气，并在-60的冷却面上复变成冰；同例，如将-40的冰在13.3Pa时加热至-20也能发生升华现象。冷冻干燥就是根据这个基本原理进行的。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,冻干工艺包括预冻结、升华和再干燥3个阶段。冻结：制品的预冻有两种方式，其一是制品与干燥箱同时降温；另一种是待干燥箱隔板降温至-40左右，再将制品方入。前者相当于慢冻，后者则介于慢冻和速冻之间。升华：在冻结前，凝结器先
10、降温至-50以下，以免水分污染真空泵。然后启动增压泵，冻结的样品大量升华。直到用肉眼已见不到冰晶的存在，大量升华过程已基本结束。再升华：为了确保全部制品大量升华完毕，板温仍应保持一个阶段，再进行第二阶段升华。待制品温度与板温相近，表示水分已很少，冻干终点已到。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,3、真空干燥（减压干燥）是在密被容器中抽去空气后进行干燥的方法。减压干燥除能加速干燥，降低温度外，还能使干燥产品疏松和易于粉碎。此外，由于抽去空气减少了对空气影响，对保证药剂质量有一定的意义。4、喷雾干燥,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,纯度的概念是随着分离分析手段的进展而不断发展的。当一种方法已不能将某样品
11、进一步分离时，即称为该方法下纯的样品，例如，色谱纯，电泳纯，超离心分析纯等。多糖是大分子，它的纯度标准不能用通常小分子化合物的纯度标准来衡量。因为即使是多糖样品，也存在微观不均一问题。它的纯度只代表某一多糖的相似链长的平均配布。我们通常所说的多糖纯品实质上是一定分子量范围的均一组分。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,目前常用的鉴定方法有四种：超离心，电泳法,旋光测定及凝胶色谱。凝胶色谱法又分为常压色谱和高压色谱法。高压色谱法即效液相高色谱法(HPLC)它具有快速,高分辨率和重现性好等优点,所以最为常用,而其他方法误差相对较大.通常多糖纯度需要用上述二种或两种以上方法的结果才能肯定其均一性.,第4
12、章 多糖的干燥和纯度鉴定,一、常压凝胶过滤,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,凝胶过滤法又可称凝胶柱层析法。由于凝胶具有一定孔径大小，故不同形状和大小的多糖分子在凝胶层析柱中移动速度亦不同，其规律是较大分子移动的较快，较小分子移动的较慢,流出液经示差检测仪检测,如只有一个对称峰,则表明是均一组分。凝胶层析法可分为常压柱层析和高压柱层析两种。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,常压柱层析的柱可以自己装,装置简单,但因条件不易控制,误差较大.试剂和仪器:0.02 0.2mol/LNaCl,0.04mol/L吡啶0.02mol/L醋酸（1：1）,分析纯葡萄糖,Dextran 2000或蓝色葡聚糖,各种葡聚糖
13、凝胶（Sephadex）,恒流泵，自动部分收集器。操作：估计被测多糖的可能分子量，先选择合适的凝胶，对于Sephadex应选择G50的各种规格。将凝胶溶胀，装柱，用缓冲液平衡一天。上样，分部收集流出液。例如，选用直径为1.4cm的玻璃柱,装载Sephadex G-200,柱高为37cm，用0.05mol/L NaCl平衡一天，流速为56mL/h，然后样品上柱（10mg）,仍保持上述流速，按3mL体积分部收集。用苯酚硫酸法测定，画出流出体积与糖浓度的关系曲线。若为形状对称的单一峰，则表示为均一组分。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,注意:凝胶装柱必须一次装毕,这样柱内凝胶均匀.平衡流速不应大于展层
14、流速.内容物(载体)柱高与直径之比应在2030之间.样品展层完毕后,记录洗脱体积Ve(即记录仪上峰尖的保留时间),然后将Dextran 2000或蓝色葡聚糖及葡萄糖分别相继上样,条件应控制与样品展层时一致.分别获得洗脱体积V0和总体积Vt.样品洗脱体积Ve 应大于V0,小于Vt.如果Ve 小于等于V0,说明凝胶选择错误,使之纯度鉴定的结果也不正确,应重新选择Sephadex G-150或G-200,甚至Sepharose2B等更大的凝胶.如果Ve大于等于Vt同样说明凝胶选择错误,应选择Sephadex G-75或G-50,甚至更小的凝胶,重新上样测定多糖样品的纯度,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定
15、,二、比旋 原理：不同的多糖具有不同的比旋度,同时在不同的低级醇(如乙醇)中有不同溶解度。在一定浓度的低级醇中，分子量大的较分子量小的溶解度小。所以，如果不同浓度的低级醇中得到的多糖沉淀的比旋度相同，则证明该多糖为均一组分。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,操作：1、多糖样品溶于水（半饱和）2、滴加达到10-20%乙醇浓度，离心得沉淀物（第一次）3、上清液再滴加乙醇，使浓度达到20-40%，离心得到第二次沉淀。4、分别干燥 第一、二次沉淀物，在相同条件下溶水测比旋度。D22.5=/PL：测得的旋光值；P：每ml溶液含溶质的克数；L：旋光管的长度（单位为分米）,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,三、电
16、泳 1、醋酸纤维薄膜电泳 试剂:醋酸纤维薄膜缓冲液:0.025 mol/L硼酸缓冲液,pH12.5；染色剂:0.5%甲苯胺蓝溶液或0.3%阿利新兰的3%醋酸溶液 操作:取醋酸纤维薄膜（28cm）放在缓冲液中浸泡1520min。取出膜条,夹在两层滤纸内吸去多余的缓冲液.另切15mm薄膜浸渍样品溶液约1uL(10ug),紧贴在离膜条一端2cm处,使膜条点上细条状的多糖样品。然后按一般常规电泳方法,两端用纸搭桥,电泳250V,电泳时间20min,然后在90%的乙醇或1%醋酸中漂洗,直至无糖区底色脱净为止。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,三、电泳2、高压电泳法 原理：在电场作用下，按其分子大小，形状及
17、其所带电荷的不同而移动不同的距离。中性多糖虽不带电荷，但它的分子里若有顺式的邻二醇，就能与硼砂形成复合物而带电荷，不同多糖的位阻因素决定了多糖与硼砂形成不同的复合物，所以在电场作用下，多糖的相对迁移率常因复合物的不同而不同。载体一般用玻璃纤维纸，这种载体电渗作用较大。对于中性多糖，它的硼砂复合物的电渗作用大于电泳作用，所以其总的电泳方向是向负极移动的。试剂和仪器：玻璃纤维纸，高压电泳仪，pH9.3的硼砂缓冲液（0.025mol/L硼砂10H2O:0.1mol/L NaOH=10:1,pH9.3）显色剂：对甲氧苯胺乙醇液,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,操作：首先点样预试验以决定最佳点样浓度。然后
18、正式点样与玻璃纤维纸上。纸的宽度应小于5cm（否则电流强度太大，纸易烧断）。用硼砂缓冲液润湿玻璃纤维纸，要注意掌握纸的湿润度，太湿则点样易扩散，太干则影响电流通过。然后将纸平整地置于高压电泳槽中，密闭，开启冷却器（也可用循环冷水）,接通电泳，逐步提高电压，使达到30b50V/cm，开始计时，电泳时间为30120min。电泳完毕，玻璃纤维纸用电吹风吹干，喷对甲氧苯胺显色剂，置于120烘箱中（20min）.显色后呈一个斑点，则证明为均一组分。如不显色，则直接将纸条按一定长度（1cm）剪下，分别放入试管中，用水洗脱，然后每管用酚硫酸法比色测定多糖含量，得到洗脱曲线。如果只呈一个锋，则说明为均一组分，
19、但采用洗脱比色法误差很大。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,注意：玻璃纤维纸上点样的浓度很重要，太稀不显色，太浓会脱尾巴，所以必须预先试验浓度。目前玻璃纤维纸均是进口的,若没有,则可用纯丝的绸布代替之,但事先须将绸布经充分洗涤.酸性多糖还可以用聚丙烯酰胺凝胶电泳或纤维素醋酸脂薄膜电泳。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,三、电泳3、聚丙烯凝胶电泳 此电泳垂直管形盘装电泳,也曾试用与中性多糖,用高碘酸西夫试剂染色,可得紫红色分级不好,则色带宽,色不均一,如有游离蛋白质未除尽,一般移动速度较快,呈现较深的紫色窄带.试剂:缓冲液:Tris-HCl 缓冲液,pH=9.1,指示燃料:秀酚蓝,染色剂:凝胶用高碘
20、酸西夫试剂染色,高碘酸西夫试剂:高碘酸-1.2g高碘酸溶于30ml水中,加入15ml0.2mol/L醋酸钠及100ml乙醇,放置暗处,可使用数日。操作:点样用样品胶,电压500V,电泳2mA/管,时间2.5小时。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,讨论:多糖或糖蛋白的聚丙烯酰氨凝胶电泳后,也可用麝香草酚溶剂混合物染色。先把胶条浸入0.2%麝香草酚溶液中,然后浸泡在80%硫酸20%乙醇的混合物中,多糖或糖蛋白显红色。如为硫酸软骨素类,染色可用0.1%阿利新蓝在0.6mol/LHCl中。以后用7%醋酸,0.6mol/LHCl漂洗。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,4、琼脂糖凝胶电泳 试剂:琼脂糖制板(5
21、.0*7.5cm),0.1cm厚.可直接用0.5%琼脂糖溶液或0.9%琼脂糖溶液以0.06mol/L巴比妥缓冲液(pH8.6)稀释成0.5%制板。缓冲液:0.06mol/L巴比妥缓冲液或0.05mol/L乙二胺缓冲液(pH8.5)。操作:离琼脂糖板下端边缘1cm处挖空(孔径0.2cm),加样量3 5ul(约含1 10ug多糖)。电压150V,电泳1 1.5h后,染色并脱色,是向阳极泳动。样品以酸性多糖为宜,因甲苯胺蓝不易使中性糖染色。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,5、玻璃纤维纸电泳原理：在电场作用下，按其分子大小，形状及其所带电荷的不同而移动不同的距离。中性多糖虽不带电荷，但它的分子里若有顺
22、式的邻二醇，就能与硼砂形成复合物而带电荷，不同多糖的位阻因素决定了多糖与硼砂形成不同的复合物，所以在电场作用下，多糖的相对迁移率常因复合物的不同而不同。载体一般用玻璃纤维纸，这种载体电渗作用较大。对于中性多糖，它的硼砂复合物的电渗作用大于电泳作用，所以其总的电泳方向是向负极移动的。试剂和仪器：玻璃纤维纸，高压电泳仪，pH9.3的硼砂缓冲液（0.025mol/L硼砂10H2O:0.1mol/L NaOH=10:1,pH9.3）显色剂：对甲氧苯胺乙醇液,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,操作：首先点样预试验以决定最佳点样浓度。然后正式点样与玻璃纤维纸上。纸的宽度应小于5cm（否则电流强度太大，纸易烧断
23、）。用硼砂缓冲液润湿玻璃纤维纸，要注意掌握纸的湿润度，太湿则点样易扩散，太干则影响电流通过。然后将纸平整地置于高压电泳槽中，密闭，开启冷却器（也可用循环冷水）,接通电泳，逐步提高电压，使达到30b50V/cm，开始计时，电泳时间为30120min。电泳完毕，玻璃纤维纸用电吹风吹干，喷对甲氧苯胺显色剂，置于120烘箱中（20min）。显色后呈一个斑点，则证明为均一组分。如不显色，则直接将纸条按一定长度（1cm）剪下，分别放入试管中，用水洗脱，然后每管用酚硫酸法比色测定多糖含量，得到洗脱曲线。如果只呈一个锋，则说明为均一组分，但采用洗脱比色法误差很大。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,注意：玻璃纤维
24、纸上点样的浓度很重要，太稀不显色，太浓会脱尾巴，所以必须预先试验浓度。目前玻璃纤维纸均是进口的,若没有,则可用纯丝的绸布代替之,但事先须将绸布经充分洗涤.,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,四、超离心分析 原理：微粒在离心力场中移动的速度与微粒的密度、大小与形状有关，如果某一种多糖在离心力场作用下形成单一区带，则表明其分子的密度、大小和形状相似。试剂和仪器：0.1mol/L NaCl，0.1mol/Ltris-HCl缓冲液，超速离心机（60000r/min操作：将多糖样品溶于水或0.1mol/L NaCl或0.1mol/Ltris-HCl缓冲液中，使多糖浓度为15%,置离心管中，进行超速离心.待离
25、心机转速达50000r/min后，开始照相,以后每间隔510min照相一次，共照相5次，即转速达60000r为最后一次照相,若5次照相所得的峰均为一个对称的锋，则证明该多糖为均一组分。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,五、高效液相色谱 高效液相高色谱法具有快速,高分辨率和重现性好等优点,是目前最为常用的鉴定多糖纯度的方法。根据多糖的分子量范围,选择合适的商品柱和流动相。将多糖的样品配制成适宜的浓度,加样,控制流速,经示差折光检测器,HP化学工作站数据处理,看样品经HPLC分析结果后的色谱峰的形状否为单一对称峰。如是,则该多糖为均一组分。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,试剂和仪器:0.05mol/
26、L PBS(Ph6.0),高效液相色谱仪,示差折光检测仪,商品柱如:Bio-gel TSK-40,TSK-50不锈钢柱(3007.5mm)目前最常用的商品柱是Bondagel 柱系列和TSK 柱系列(见表1和表2)。常用水,缓冲液和含水的有机溶剂作为流动相。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,常用商品柱表1Bondagel 商品柱(Waters Assoc.)型号 分离范围(分子量)Porasil GPC 6 10-3m 10010,000Bondagel E-125 2,00050,000Bondagel E-500 5,000500,000Bondagel E-1000 50,0002,000
27、,000Bondagel E-Linear 2,0002,000,000Bondagel E-high A 15,0007,000,000,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,表2 TSK商品柱(Bio-Rad)型 号 分离范围(分子量)Bio-Gel TSK-30 100,000Bio-Gel TSK-40 1,000700,000Bio-Gel TSK-50 10,0002,000,000Bio-Gel TSK-60 100,00020,000,000,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,操作:样品分别溶于缓冲液,浓度为0.2%(W/V),离心三分钟,(16000r/min),上清夜进样量20uL,流速0.5ml/min,示差仪检测,记录仪纸速1mm/min,温度为室温.根据使用二种缓冲液后层析结果,如果均是一个对称峰,则多糖为均一组分。注意:对于酸性多糖,检测仪可以单独使用示差仪,更理想是示差仪与紫外检测仪联用。酸性多糖也可单独使用紫外检测仪。TSK-40与TSK-50串连使用可检测分子量范围在10002 000 000的多糖的纯度。示差仪具中等灵敏度,其线形关系的最低敏感量为20ug,最大敏感量为400ug,所以必须严格控制进样浓度。,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,第4章 多糖的干燥和纯度鉴定,
