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1、1,1,饲料分析技术,畜牧兽医学院动物科学系 吉林大学 金永成 邮箱：电话：13756306687,09级动物科学(1班、2班、实验动物),2,3,是一类不溶于水而易溶于乙醇、丙酮等有机溶剂的有机化合物以液态或固态形式普遍存在生物界正常情况下，人体中占1420%14%为消瘦20%则为肥胖，60%为极度肥胖,4,5,神经鞘脂类,醇类,胆固醇,脑苷脂类,脂肪酸,糖脂,磷酸甘油酯,甘油三脂,6,7,食物与人体内脂肪的最重要组成形式 3 份脂肪酸与1个甘油分子以酯键连接 根据脂肪酸不同，分为中链三酰甘油(MCT)长链三酰甘油(LCT),三酰甘油=甘油+3 份脂肪酸,8,LCT and MCT-a ph
2、ysical mixture,Glycerol,LCT-Long-Chain Triglycerides(as in Intralipid),Glycerol,MCT-Medium-Chain Triglycerides,9,Reesterification(再酯化)STG,STG-structured triglycerides in Structolipid,10,供能:9(kcal/g)能量储存(脂肪组织内三酰甘油)转运形式(脂蛋白,游离脂肪酸)绝缘层：器官保护层膜的组成成分(脂、蛋白共同构成)细胞膜、神经髓鞘(绝缘体)、细胞表面(磷酸甘油酯)、抗原性(糖脂类)免疫调节类花生酸 如前列腺
3、素(刺激平滑肌细胞收缩)前体 固醇类激素、胆盐、维生素D前体,脂肪的功能,11,决定脂肪酸的熔点链长：C原子数-熔点饱和性/双键数：双键数-熔点,脂肪酸 特征,12,（一）甘油三酯功能 1)体内贮存和提供能量 2)维持体温正常 3)保护作用 4)内分泌作用 5)有效地利用碳水化合物和节约蛋白质作用 6)机体重要的构成成分,甘油三酯在营养学上的功能 1.增加饱腹感；2.改善食物的感官性状 3.提供脂溶性维生素,13,（二）磷脂 1.磷脂：指甘油三酯中一个或两个脂肪酸被含磷酸的其它基团所取代的一类脂类物质。其中最重要的磷脂是卵磷脂(1ecithin)，它是由一个含磷酸胆碱基团取代甘油三酯中一个脂肪
4、酸而形成的。,14,2.磷脂功能：1）提供能量 2）细胞膜的构成成分，促进细胞内外的物质交流作为乳化剂有利于脂肪的吸收、转运和代谢。,15,3.磷脂的缺乏：造成细胞膜结构受损，毛细血管的脆性和通透性增加，引起水代谢紊乱，产生皮疹。,16,一、按其碳链长短分类 长链脂肪酸(14碳以上)中链脂肪酸(含812碳)短链脂肪酸(6碳以下),17,二、按其饱和程度分类 饱和脂肪酸 单不饱和脂肪酸 多不饱和脂肪酸,18,饱和、单不饱和、多不饱和脂肪酸的结构,19,不饱和脂肪酸的类别,注：每类包含一系列脂肪酸，各脂肪酸能从母体脂肪酸合成 如花生四稀酸（C20:4,n-6）由亚油酸（C18:2,n-6）合成,2
5、0,体内多不饱和脂肪酸(n-3，n-6类)合成途径摘自Modern Nutrition in Health and Disease,第9版，第82页，1999年。,21,22,三、按其空间结构不同分类 顺式脂肪酸(cis-fatty acid)反式脂肪酸(trans-fatty acid),23,四、营养学上最具价值的脂肪酸有两类 n-3(或-3)系列不饱和脂肪酸,即从甲基端数，第一个不饱和键在第三和第四碳原子之间的各种不饱和脂肪酸；n-6(或-6)系列不饱和脂肪酸，从甲基端数，第一个双键在第六和第七碳之间。CH3(CH2)nCH2COOH甲基端 羧基端,24,摘自Modern Nutriti
6、on in Health and Disease，第9版,第68页，1999年。,25,26,必需脂肪酸(essential fatty acid，EFA)：是指人体不可缺少而自身又不能合成，必须通过食物供给的脂肪酸。n-6系列中的亚油酸和n-3系列中的-亚麻酸是人体必需的两种脂肪酸。,27,必需脂肪酸功能 1）是磷脂的重要组成成分 2）与精子形成有关 3）是合成前列腺素的前体 4）有利于组织修复 5）与胆固醇的代谢有关,28,按碳链长度长链脂肪酸（14 26C）中链脂肪酸（8 12C）短链脂肪酸（2 6C）从结构饱和脂肪酸（不含双键）不饱和脂肪酸（含有一个或多个双键）单不饱和脂肪酸多不饱和脂
7、肪酸,按营养角度必需脂肪酸:不饱和/高度不饱和脂肪酸亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸非必需脂肪酸：饱和/低度不饱和脂肪酸按其空间结构不同分类顺式脂肪酸(cis-fatty acid)反式脂肪酸(trans-fatty acid),29,粗脂肪分析方法 Soxhlet(索氏)萃取法:最一般的脂类定量方法 Weibull-Stoldt 法(酸分解法):碳水化合物和蛋白质的影响下脂类提取困难时-其他:Rose Gottlieb法(氨基酸分解法),Gerber法,NIR,超声波法,30,1.Soxhlet(索氏)萃取法-从1879年介绍以至今广范围使用的方法-最广范围使用的脂肪分析法 用Petroleum
8、ether,diethyl ether等低沸点溶液提取样品中的脂肪 提取 干燥 重量差值 确定脂肪含量-分析步骤 样品前处理:干燥,粉碎,Na2SO4脱水,Cu(OH)2 沉淀 提取 溶液挥发 干燥到适当 确定粗脂肪含量 干燥后重(g)100/样品重(g),31,1.Soxhlet(索氏)萃取法的优缺点-优缺点 不需要加水分解节省时间 仪器价格低廉 广范围的应用 蛋白质、碳水化合物含量高时不适用 随溶剂的种类、提取时间的变化结果不同 其他亲水性物质也一块提取 磷脂只能部分提取需要大量的溶剂，制动化不易-应用分支 一般食品行业 为其他分析而除去脂肪,32,2.酸水解(acid hydrolysi
9、s)酸水解的必要性 直接用Soxhlet(索氏)提取法不能把所有的脂肪提取出来碳水化合物、蛋白质等把脂肪包裹的情况 植物细胞或starch-membrane(淀粉膜)中掺杂的情况 非溶性胶质把脂肪包裹的情况(牛奶、乳酪、奶油)乳制品、谷类、面包、蛋类、鱼类、肉类、豆腐原理试样经酸水解后用乙醚提取，除去溶剂即得总脂肪含量。酸水解法测得的为游离及结合脂肪的总量-酸分解过程 加入4M HCl时样品的matrix 成分分解 过滤后脂肪分离 用热水洗涤 干燥之后提取,干燥后测量重量变化计算脂肪含量,33,3.其他 fat 分析方法 Phospho-,di-,monoglyceride(磷脂、甘油二酯、甘
10、油单酯)比起一般只有三个脂肪酸的甘油三酯具有低的热量 各脂肪含有磷脂(Phosphatide)的混合物时磷脂可以分离为脂肪但是在提取过程中会有部分的损失因此完美的提取很困难原理试样经酸水解后用乙醚提取，除去溶剂即得总脂肪含量。酸水解法测得的为游离及结合脂肪的总量,34,原理,为了脂肪样品的气象色谱分析，首先要分离为单一的脂肪酸状态脂肪(或者脂类、不溶于水但是溶于有机溶剂的特性的物质)大概分为单纯脂肪(Triglycerides,diglycerides,monoglycerides,free fatty acids cholesterol esters,cholesterol and waxe
11、s esters)和极性或者复合脂肪(磷脂及糖脂)脂肪可以通过多种有机溶剂从组织中提取但是对于组织的酶类和非活性化的脂肪要完全提取出需要注意,35,具有细胞壁的复合脂肪具有hydrogen bond或 hydrophobic forces 及ionic bond的蛋白质及碳水化合物的细胞内的其他化合物连接，因此不容易提取从组织中提取脂肪需要用像chloroform(氯仿)一样可以溶解脂肪还可以与 methanol一起把脂肪和组织之间的matrix之间的相互作用给分解的溶剂糖(sugars)、氨基酸及盐(salts)等non-lipid contaminants需要通过washing proce
12、dure从提取物中剔除掉，这样的方法可以参考Folch,Lees 及 Stanley(1957)的建议,36,用chloroform-methanol(2:1,v/v)把提取物进行摇荡后加入占体积的saline solution(0.88%in water)进行平衡这时混合物分成2个层,下层为氯仿层包含所有脂肪，上层为methanol-water phase包含non-lipid contaminants,方法:,2.脂肪提取,样品:flax seed(亚麻籽),margarine(人造黄油),ground beef,Blank(不含所测物质),试剂:1)Folch solution:chlo
13、roform:methanol(2:1,V/V)2)0.88%NaCl,提取步骤:,1)准确称取1.0g ground beef,0.2g的flax seed 或 0.1g的 margarine 放入50ml Teflon lined screw cap tube后加入 20ml的 Folch solution。,37,2)Homogenizing3)拧紧盖子并在 在室温12h 摇晃(必要时加入 N2)加入 4ml的0.88%NaCl，并充分混合 1500rpm，4，10min centrifuge.分2层.记下Chlorform层的体积，并把上层(methane+water)吸取掉，下层则包
14、含所要提取的脂肪这样分离的脂肪用于分析如下:Total crude lipid analysisFatty acid analysisLipid class separation by TLC and their fatty acid compostionLipid class quantitation by Iatroscan,38,A.Total Crude Lipid analysis,a.把下层即chloroform层用吸管移入到 glass vialb.在加入N2 gas的情况下挥发溶剂(chloroform)。要充分挥发后承重。c.计算:,B.脂肪酸(fatty acid)分析 通
15、过气象色谱仪识别波峰并且利用面积(%)计算样品中脂肪酸的成分,理论,利用GC分析脂肪的脂肪酸成分需要把脂肪酸进行甲酯化(methyl ester)，转换成低分子亮的非极性(non-polar)诱导体。为了把样品变成挥发性变成诱导体可以增加安全性，减少活性，变化成可分理性改善测定效率。根据这个原理可以改善波峰的色谱性,39,Methyl ester(甲酯化)方法:,Esterification,Free fatty acid,Methanol,Acid HCl or BF3,Methyl ester,+,H2O,Methanol,Transesterification,Glyceride mix
16、ture,Methyl ester,+,-C-OH,-C-OH,-C-OH,Glycerol,BF3+methanol mixture(35%BF3/methanol(14%)+45%methanol+20%hexane)2ml,40,加入N2 gas，把Chloroform 层挥发(5060)加入 BF3+methanol mixture(35%BF3/methanol(14%)+45%methanol+20%hexane)2ml 并加入N2 gas后拧紧盖子.vortexing.在100 加热3060min,隔15min进行shaking(vortexing).室温静置，加入12ml he
17、xane(己烷)和1ml 0.88%NaCl 混合离心取上层液转入小玻璃瓶盖上盖子GC 分析,Methyl ester(甲酯化)步骤:,41,42,The Agilent 7890A Gas Chromatograph,43,44,45,Filters/Traps,Column,Gas Chromatography,gas systeminletcolumndetectordata system,Data system,Syringe/Sampler,Inlets,Detectors,Regulators,46,47,Gas Chromatography原理示意图,48,49,GC 探测器,燃
18、烧性探测器(1)Flame Ionization Detectors(FID)(2)Nitrogen Phosphorous Detector(NPD)(3)Flame Photometric Detector(FPD)-非燃烧性探测器(4)Thermal Conductivity Detector(TCD)(5)Electron Capture Detector(ECD)(6)Photo Ionization Detector(PID)注意事项燃烧性探测器(FID,NPD,FPD)使用3种气体(补充气体:make-up gas,氢气,空气)非燃烧性探测器(TCD,ECD,PID)只是使用运送
19、气体和补充气体,50,51,Column effluent is passed through a H2-Air flame Produces ions and electrons Charged particles are accelerated by voltage applied between jet and collector results in current(pA)Number of ions depends on number of reduced(methylene)carbons in molecule one molecule of ethane gives twice
20、 the signal of one molecule of methane less sensitive for non-hydrocarbon groups insensitive to H2O,CO2,SO2 and other noncombustibles(Nox)High sensitivity(10-13 g/s)good LDR(Wide dynamic range)(107),low noise,destructive technique,Flame Ionization Detector(FID),52,53,54,55,56,WCOT vs.SCOT vs.PLOT,57,58,59,1.2.3 结果分解理想的气象图谱是波峰之间紧凑但是没有交叉波峰的大小根据样品混合物的量一致，当混合物浓度增加会得到大的波峰。-混合物通过column需要的时间来定性分析成分(停留的时间:retention time),即可以确定为何种物质。,60,DISADVANTAGES OF GAS CHROMATOGRAPHY,Material has to be volatilized at 250 without decomposition.,61,Gas Chromatogram of Methyl Esters of Fatty Acids,62,
