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1、血细胞分析仪的溯源、校准及比对,湖南省临床检验中心佘 鸥,临床检验的目标：为临床报告准确可靠的结果!,一个实验室测定结果的可靠性精密度、准确性、可比性所决定,什么是溯源？,国际标准 时间,北京时间,纽约时间,个体时间,个体时间,格林威治时间平子夜,父亲 儿子 女儿 1/2 孙子 孙女 外孙 外孙女 3/4,溯源性 通过一条具有规定不确定度的不间断的比较链，使测量结果或测量标准的值能够与规定的参考标准，通常是与国家标准或国际标准联系起来的特性,不确定度 表征合理地赋予被测量之值的 分散性与测量结果相联系的参数,红细胞、白细胞计数国际参考方法,电子细胞计数仪,血红蛋白分析的国际参考方法,分光光度计
2、氰化高铁血红蛋白法,血小板分析的国际参考方法,采用流式细胞术：CD41 和 CD61，得到红细胞总数和血小板总数的比率再根据血小板和红细胞的比率，乘以红细胞参考方法所检测的红细胞真值来间接计算出血小板的真值,红细胞比积测定国际参考方法,改良精密毛细管法从开始操作开始到往精密毛细管内吸人红细胞的步骤是相同的但是计算时仅取中央部分通过国际参考方法测定该部位的血红蛋白浓度其结果与国际参考方法测得的全血的血红蛋白浓度的比率为 HCV,全球首台商用血细胞计数仪,希森美康首台血液分析仪,临床检验量值的计量学溯源(ISO 17511),血细胞计数的溯源性,参考计数仪,常规的 其他分析仪,NCCL的F-820
3、,各省检验中心的F-820,一级标准器 卫生部临检中心 配套质控物比对 二级标准器 湖南省临检中心 新鲜血比对常规 常规 常规 常规检测系统 检测系统 检测系统 检测系统 常规临床实验室 湖南省血细胞分析仪量值溯源网络,HNCCL使用Eightcheck-3WP全血质控物室内质控测定结果的年平均CV（%）值WBC RBC HGB HCT MCV MCH MCHC PLT2003 0.92 1.50 1.00 2.91 1.11 1.87 2.10 3.402004 0.70 1.21 0.60 1.85 1.38 1.26 1.94 2.12 2005 0.84 0.57 0.36 0.66
4、0.49 0.48 0.65 2.082006 0.77 0.47 0.42 0.78 0.64 0.54 0.87 1.652007 0.75 0.48 0.35 0.88 0.71 0.47 0.72 1.54,HNCCL二级标准检测系统检测Eightcheck-3WP 全血质控物结果与靶值偏倚的绝对值的年平均值 WBC RBC HGB HCT MCV MCH MCHC PLT2003 0.96 4.03 0.79 3.71 0.77 4.16 3.79 12.112004 0.83 3.28 0.78 3.18 0.87 4.19 3.76 8.082005 0.63 0.87 0.80
5、 3.20 5.30 0.86 4.98 4.942006 0.63 0.46 0.82 2.11 3.05 0.96 3.53 1.372007 0.64 0.66 0.70 2.28 2.10 1.01 3.21 3.87,什么是校准？,校准 在规定条件下，为准确测量仪器或测量系统所指示的量值，或实物量具及参考物质所代表的量值，与对应的由标准所复现的量值之间关系的一组操作称之为校准,检测系统 完成检验所需要的仪器、试剂、校准品和操作程序的 组合为检测系统,检测系统,医疗机构临床实验室管理办法,第二十四条 医疗机构临床实验室应当保证检测系统的完整性和有效性，对需要校准的检验仪器、检验项目和对
6、临床检验结果有影响的辅助设备定期进行校准,完整性：组成检测系统的各要素是完整的，即仪器、试剂、校准物、检测程序缺一不可有效性：由该检测系统测量得到的检测结果是准确的、可靠的，且与确认准确、可靠的检测系统的结果具有可比性,自建检测系统存在的问题 没有批文 没有配套的校准物 怎样保证检测结果的可靠性和溯源性 存在举证隐患,保证检测系统的完整性和有效性 对检测系统性能的核实 对检测系统性能的确认 对检测系统性能的评价,对检测系统分析性能评价 1、不精密度（总不精密度）2、不准确度（方法学比较结果）3、病人结果可报告范围 4、分析灵敏度（检测限）5、分析特异性 6、参考范围 7、其他需说明的性能,NC
7、CLS EP-5文件精密度实验方法,对稳定的实验样品每天做二批实验，批间相隔的时间不少于2小时，每批对样品做双份测定，共做20天实验一共有80个结果，40对。每对结果间的差是每批的批内差。在20天共有40批，这些差值客观地反映了较长时间周期内的批间不精密度,校准物 含有已知量的欲测物，用以校准该测定方法的数值，它与该方法及试剂、仪器是相关联的 质控物 只用于和待测标本同时测定的，为了控制标本的测定误差，因此要求保存时间十分稳定,校准物具有溯源性和不确定度 意思：经该校准物校准的检测系统检测新鲜血的量值具有溯源性，其被赋予的校准值具有不确定度,校准物质控物 决不能用定值质控物代替校准物校准仪器！
8、,校准物,来源 配套校准物 定值新鲜血新鲜血的定值 直接溯源至国际标准 间接溯源至国际标准 二级标准检测系统 规范操作的检测系统,精密度 在规定条件下获得的独立测量结果之间的接近程度变异系数 不精密度准确度 一次测量结果与被测量真值的接近程度偏倚 不准确度,总误差 系统误差(SE)和随机误差（RE）的总和允许总误差 在临床可接受的水平范围内的总误差,建立校准方法,1、选择合适的校准品：包括数量、类型和浓度2、校准品应能溯源到参考方法或参考物质3、确定校准频度,校准方法,1、仪器的准备 先用清洁剂对仪器内部各通道及测试室处理30分钟。确认仪器的背景计数、精密度及携带污染在说明书规定的范围内时，才
9、可进行校准，否则须查找原因，必要时请维修人员进行检修,2、校准物的准备配套校准物：将校准物从冰箱内（2-8取出后，要求在室（18-25）条件下放置15分钟，使其温度恢复至室温检查校准物是否超出效期，是否有变质或污染轻轻地将校准物反复颠倒混匀，并置于两手掌间慢慢搓动，使校准物充分混匀打开瓶塞时，应垫上纱布或软纸，使溅出的血液被吸收将两瓶校准物合在一起，混匀后再分装于2个瓶内,新鲜血作为校准物：用EDTAK2为抗凝剂的真空采血管取健康人新鲜血10ml，每ml血需抗凝剂的浓度为1.5-2.2mg。要求新鲜血的Hb、WBC、RBC、Hct和Plt检测结果在参考范围内。将新鲜血混匀后分装于3个管内，每管
10、的血量为3ml。取其中1管，用二级标准检测系统或规范操作的检测系统连续检测11次，计算第2-11次检测结果的均值，以此均值为新鲜血的定值。其他2管新鲜血作为定值的校准物，用于仪器的校准。,3、对校准物进行检测,1、取1瓶校准物，连续检测11次，第1次检测结果不用，以防止携带污染。2、仪器若无自动校准的功能，则将2-11次的各项检测结果用手工记录在工作表格中，计算出均值，均值的小数点后数字保留位数较日常报告结果多一位。有自动校准功能的仪器可直接得出均值。,计算各参数的偏差的百分数 公式：均值-定值 偏差(%)=100%定值 若仪器无自动校准功能，则将定值除以所测均值，求出校准系数，将仪器原来的系
11、数乘以校准系数即为校准后的系数，将校准后的系数输入仪器更换原来的系数 新校准系数=旧校准系数定值/均值,仪器校准的判别标准 参 数 百分数差异 一列 二列 WBC 1.5%10%RBC 1.0%10%HGB 1.0%10%HCT 2.0%10%MCV 1.0%10%PLT 3.0%15%,校准前各参数均值及偏差 参数 F-820 BC-3000 偏差(%)WBC(109/L)6.85 7.42 8.32RBC(1012/L)4.98 5.15 3.40HGB(g/L)161 160 0.62HCT(%)40.45 42.12 4.13MCV(fl)91.10 89.30 1.97PLT(109
12、/L)118 134 13.50,校准后各参数均值及偏差 参数 F-820 BC-3000 偏差(%)WBC(109/L)6.85.85 0.00 RBC(1012/L)4.98 5.00 0.40 HGB(g/L)161 160 0.62 HCT(%)40.45 41.12 1.66 MCV(fl)91.10 91.50 0.43 PLT(109/L)118 121 2.54,4、校准结果的验证,将第2管未用的校准物充分混匀，重复检测11次，去除第1次结果，计算第2-11次检测结果的均值，再次与表中的数值对照。如各参数的差异全部等于或小于第一列数值，证明校准合格。如达不到要求，须请维修人员进
13、行检修。,校准文件应包括的内容,1、校准方法 2、校准物 3、校准的频度 4、校准程序 5、校准记录,什么是比对试验?,可比性 不同检测系统或不同检验方法对一批病人标本测定结果的一致程度,实现可比性的大体步骤,核实检测系统的主要分析性能病人结果可报告范围检测系统的精密度检测系统的准确度方法学比较试验临床可接受性能评价自建检测系统的校准,NCCLS EP9-A,用患者样本进行方法学对比及偏差评估EP-9-A指南文件（Method Comparison and Bias Estimation Using Patient Samples;Approved Guideline,EP9-A）,要 求,实
14、验室使用一台以上的仪器进行同一试验，须每年至少进行两次病人结果的比对,检验程序的质量保证,5.6.1 实验室应设计内部质量控制体系以验 证检验结果达到预期的质量标准 5.6.2 适用且可能时，实验室应确定检验结 果的不确定度 5.6.3 应设计并实施测量系统校准和真实度 验证计划，以确保结果可溯源至SI单 位（溯源性）5.6.4 实验室应参加如外部质量评价计划组 织的实验室间比对活动,ISO15189,检验程序的质量保证,5.6.5 当确实无正式的实验室间比对计划可供利用时，实验室应建立机制，用于决定未经其他方式评 估程序的可接受性 5.6.6 当同样的检验应用不同程序或设备，或在不同 地点进
15、行，或以上各项均不同时，应有确切机 制以验证在整个临床适用区间内检验结果的可 比性5.6.7 实验室应文件化并记录比对活动，只要适用，针对其结果迅速采取措施。对识别出的问题 或不足应采取措施并保留记录,ISO15189,分析质量指标,允许不精密度 允许偏差 允许总误差“建立全球检验医学质量技术要求的策略会议”,设定分析质量指标,95%PT成绩在CLIA88允许误差范围内 检测系统间的相对偏差1/2 CLIA88 批内不精密度1/4 CLIA88 日间不精密度1/3 CLIA88追求批内不精密度、日间不精密度、不同检测系统间的系统误差 1/6 CLIA88,系统比对质量标准 参 数 总允许误差
16、1/2允许误差 WBC 15 7.5 RBC 6 3 HGB 7 3.5 HCT 6 3 PLT 25 12.5,CAP认可要求,实验室必须验证或建立每个试验的准确度和精密度并有记录,精密度性能确认方法,对稳定的实验样品每天做二批实验，批间相隔的时间不少于2小时，每批对样品做双份测定，共做20天实验一共有80个结果40对,每对结果间的差是每批的批内差。在20天共有40批，这些差值客观地反映了较长时间周期内的批间不精密度,准确度性能确认方法,对检测系统进行校准和校准验证能力验证结果，分析前次的PT标本，与回报结果比较由供应商或制造商提供关于试剂、程序或检验系统溯源性的声明文件应用有证参考物质分析
17、病人标本，将结果与参考方法的检测结果比较分析病人标本，将结果与实验室过去确认的方法检测结果比较,可报告范围核实实验,分析测量范围（AMR)：分析方法能直接测定样本中的待测物质而不需稀释或浓缩或其它的预处理临床可报告范围（CRR):样本可通过稀释或浓缩或其它的预处理，以扩展其准确测定的范围，可结合临床要求,分析灵敏度（最低检测限）,分析至少4个浓度水平的校准品或能力验证标本或线性标准和空白，将结果作图，分析灵敏度是线性的最低点。如果该直线通过“0”，灵敏度即为“0”；如果灵敏度不是“0”，由最低临界值确定该灵敏度水平,分析干扰（特异性）,参考试剂盒或文献报道给出的特异性指标本实验室的PT结果与同
18、行间的一致性以反映方法的特异性可用常见的干扰物质（如血红蛋白、胆红素、脂肪等）进行干扰试验以确定方法的特异性,参考范围验证方法,分析至少20例健康自愿者（无已知疾病、能够走动、无任何用药、重量在健康范围）的标本，统计分析结果的频数分布，选择合适的统计方法确定95%的参考范围，若在推荐的参考范围内，或仅有5%的数据超出推荐的参考范围，该参考范围可接受,1、熟悉系统的各个环节和评价方案2、系统处于良好的工作状态，严格按SOP操作3、处于质量控制之下并有校准措施4、实验时间至少5天5、40份病人标本,6、50%的标本不在参考区间内7、不要使用有干扰的标本8、标本应有足够的量9、按18和81顺序10、
19、应在2小时内开始实验（当天采集的标本）,实验数据的收集、处理和应用,1、记录实验结果2、不采用已明确有人为误差的结果3、必须有室内质量控制，失控时必须重做4、对实验数据的初步检查5、作图,6、目测线性关系7、方法间配对结果离群点的检验8、检查分析物含量分布是否适当9、线性回归统计10、可接受低水平：系统误差（SE）1/2CLIA 88允许误差,11、评估医学决定水平浓度的系统误差12、r 0.975时，并不代表二个检测系统间不存在系统误差或偏倚13、r 0.975时，应改善数据分布范围或实验方法的精密度、目测线性关系,进行比对试验前要做的几点工作一、分析需要 七、回收试验二、质量目标 八、检出
20、限三、方法选择 九、干扰四、熟悉时间 十、日间精密度五、分析范围 十一、方法比较六、批内精密度,高、中、低值批内精密度全血样本的测定均值 WBC RBC HGB MCV PLT(109/L）(1012/L）（g/L)(109/L）(109/L）高值 20.1 5.51 171 91.1 552 中 值 7.9 4.51 146 94.4 275 低 值 2.1 1.53 88 97.5 69,高、中、低值全血样本批内精密度检测结果的CV(%)WBC RBC HGB MCV PLT 高值 1.32 1.14 0.83 0.23 2.79 中 值 0.85 0.96 0.92 0.33 2.86
21、低 值 2.98 1.53 0.90 0.22 4.23 平均 1.72 1.21 0.88 0.26 3.29,高、中、低值全血样本日间精密度检测结果的CV(%)WBC RBC HGB MCV PLT 高值 3.00 2.30 1.72 1.54 4.47 中 值 3.27 2.52 1.46 2.39 6.30 低 值 3.80 1.95 2.34 1.42 12.9 平均 3.35 2.25 1.84 1.78 7.89,全血样本各参数线性范围 WBC RBC HGB MCV PLT(109/L）(1012/L）（g/L)(109/L）(109/L）上限 30.0 7.64 200 69
22、.6 826 下限 3.20 0.77 33 6.9 72,校准前各参数均值与靶值比较的百分数差异(10例)WBC RBC HGB HCT MCV PLT仪器 均值百分数均值百分数均值百分数均值百分数均值百分数 均值百分数(109/L）（）(1012/L）（）（g/L)（）(）（）（fl）（）(109/L）（）7.3 4.6 153 43.8 95 186 2 7.6 5.2*4.64 0.4 152 0.7 44.3 1.1 96 1.0 203 8.9*3 7.7 6.6*4.81 3.9*141 7.6*45.1 3.0*94 0.7 167 10.0*4 7.5 3.3*4.72 2.
23、1*150 1.8*46.0 5.2*98 3.0*161 13.0*,校准后各参数均值与靶值比较的百分数差异(10例)WBC RBC HGB HCT MCV PLT仪器 均值百分数均值百分数均值百分数均值百分数均值百分数 均值百分数(109/L）（）(1012/L）（）（g/L)（）(）（）（fl）（）(109/L）（）7.3 4.63 153 43.8 95 186 2 7.2 1.3 4.64 0.4 152 0.7 44.3 1.1 96 1.0 190 2.2 3 7.2 1.2 4.67 1.0 154 0.4 44.3 1.0 95 0.2 182 2.2 4 7.3 0.0 4.66 0.7 155 0.9 43.3 1.4 95 0.7 181 2.8,谢谢！,
