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1、Chapter 2细胞工程实验室组成及 无菌操作技术,Section 1 实 验 室 组成,细胞工程实验的基本需要实验准备 包括培养基配制、器皿洗涤、培养基和器皿灭菌等无菌操作控制培养,一、实验室组成1.基本实验室准备室：准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作，要求宽敞明亮，通风条件好,准备工作器皿的洗涤培养基的配制与分装培养基和器皿的灭菌组成洗涤区灭菌区贮藏区培养基配制区,无菌操作室进行无菌操作，要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌状态组成 缓冲准备区（更换衣帽、拖鞋、洗手等）接种区（培养材料的无菌操作）无菌操作室功能简单，面积应小，门窗密闭性好，以保证其长期处于较好的无菌状态,
2、接种室,培养室对离体材料进行控制条件下的培养基本要求是能够控制光照和温度，保持相对无菌的状态温度：2527（植物），3537（动物）光照强度：20003000 lx配置适宜的培养架对于某些精细培养类型（如细胞培养和原生质体培养等），也可采用光照培养箱或人工气候室代替培养室,培养室,智能人工气候箱,光照培养箱箱,2.辅助实验室细胞学实验室对培养材料进行细胞学鉴定和研究由制片室和显微观察室组成要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染,细胞实验室,生化分析室在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查大型的次生产物生产实验室
3、，还应建立有效物质分离实验室,3.细胞工程实验室布局 便于隔离、便于操作、便于灭菌、便于观察可根据细胞工程实验的操作程序安排接种室、培养室应放在与外界环境的隔离的区域灭菌室应与接种室相邻,细胞工程实验室布局示意图,接种室,灭菌室,准备室,细胞学实验室,分析室,培养室3,培养室2,培养室1,细胞工程实验室,Section 2 仪器设备,1、基本设备,天平23台不同精度的天平（0.001或0.0001，0.01或0.1）,冰箱用于各种维生素和激素类药品及培养基母液的保存或某些实验材料的低温处理需12台，有时需用到超低温冰箱（80）,酸度计用于测定培养基及其它溶液的pH一般要求可测定pH范围1-14
4、之间，精度0.01即可,离心机用于细胞、原生质体等活细胞分离，亦用于培养细胞的细胞器、核酸以及蛋白质的分离提取细胞、原生质体等活细胞的分离用低速离心机核酸、蛋白质分离用高速冷冻离心机规模化生产次生产物，还需选择大型离心分离系统,加热器用于培养基的配制电炉、微波炉,纯水装置离体培养应使用符合试验要求的纯水或蒸馏水蒸馏水器纯水机,分装设备用于大型生产实验室培养基的分装,蒸馏水器,超纯水机,2.灭菌设备 高压蒸汽灭菌锅手提式立式卧式干热消毒柜（干热灭菌烘箱）过滤灭菌装置喷雾消毒器紫外灯,干热消毒柜,烘箱,3.无菌操作设备 超净工作台（净化工作台）通过空气过滤去除微生物和灰尘颗粒来达到净 化目的的装置
5、由鼓风机、滤板、操作台和照明灯等部分组成单人式和双人式侧流式和平流式接种箱,超净工作台,接种箱,4.培养设备 根据需要所选用的不同规格和控制精度的用于细胞、组织或器官培养的设施和设备培养架培养箱摇床（或振荡培养箱）生物反应器,光照培养箱箱,摇床,振荡培养箱,生物反应器,5.光温控制设备 照度计、时间程序控制器、空调及温度感应器,照度计,温度湿度自动记录仪,光学显微镜（Light microscopy）典型的动植物细胞直径在数十微米，比人眼最小颗粒还小5-10倍，只有借助于显微镜才可以观察到细胞内部结构分辨率人眼：R=100m光学显微镜：R=0.2m,6.细胞学相关设备,荧光显微镜（Fluore
6、scence Microscope）利用强烈的经过滤光镜过滤的激发光线，激发标本产生荧光特点：染色简便，标本呈彩色图案、明亮，灵敏度比较高,荧光倒置显微镜,荧光显微镜,相差显微镜 细胞各结构的密度不同，通过致密部分的光线速度小，与通过邻近部分的光线产生相位偏差或光程差，这种差异是人眼不可分辨出来的，显微镜利用光的衍射和干涉特性，把经过不同区域的光线的相差转化为振幅差（明暗差），使细胞各结构之间呈清晰对比。可以观察活细胞，可以在镜下连续拍摄,相差显微镜,体视显微镜及图像分析系统,体视显微镜是一种可观测到细胞等物体的立体三维图像的显微镜，可用于组织细胞培养物病理学的研究，并广泛应用于动物学、植物学
7、、地质学等,体视显微成像系统,共聚焦激光扫描显微镜（Confocal）它是在荧光显微镜成像的基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，使用紫外或激光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光三维图像，观察细胞的形态变化或生理功能的改变,Confocal,显微注射系统（Programmable Microinjector）可以将任何类型的分子或者分子结合物注射到细胞的细胞质和细胞核中去。例如，RNA，DNA，蛋白质，抗体，标记染料，人工合成的分子，多肽，以及所有的细胞器都可被注射,显微注射系统,电子显微镜 电子的波长比光短，因而用电子代替光可以大大提高显微镜的分辨率，电子运动快，
8、波长较小（如10万伏加速的电子，波长为410-3nm）电子显微镜分辨率210-3m，分辨力比普通光学显微镜高100倍，广泛应用于生物学、材料学、化学等领域 超微结构：即亚显微结构，指电镜下可以观察到的结构，如细胞器等细微结构,透射电子显微镜（TEM）使用电磁透镜，由精密线圈产生磁场，使用的照明工具是电子束，而光镜使用的是玻璃透镜。透射电子显微镜，需要超薄切片（50-100nm），将一个细胞分成100-200块分辨率：0.1nm特点：（1）透射观察，可观察到二维结构（2）可以观察到细胞内部的超微结构、局部结构（3）不可以用于观察活细胞（需超薄切片）,超薄切片机 Ultra Microtome,透
9、射电子显微镜,扫描电子显微镜（SEM）电子束经光镜聚集成极细的电子探针，在样品表面逐线扫描样品，被电子激发产生二次电子，经收集、转换，放在荧光屏上成像。样品发出电子多的地方，在屏上相应位置就变亮，反之则暗特点：（1）用于观察细胞及内部的表面结构（2）立体感强，三维结构（3）分辨力（2nm）不及透射电镜（0.1nm）高，用于单个细胞或细小的生物样品,扫描电子显微镜,流式细胞仪流式细胞法是让细胞粒子或小颗粒在细小液流的带动下逐个通过检测点，在通过检测点时受到与液流方向垂直的UV光或镭射光的照射，通过检测光信号的改变来测量细胞或小颗粒的性质 流式细胞仪能对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行
10、多参数的、快速的定量分析和分选,流式细胞仪工作原理,流式细胞仪,7.生化分析设备,高效液相色谱仪,酶标仪,Section 3 培养容器与用具,1.培养容器指盛有培养基并提供培养物生长的无菌器皿玻璃容器一般用无色并不产生颜色折射的硼硅酸盐玻璃材质（包括各种规格的培养皿、三角瓶、试管、培养瓶）塑料容器材质轻、不易破碎、制作方便，使用广泛（一次性的和可重复使用的）,培养板,培养瓶,2.金属用具细胞工程实验室的接种以及解剖工具，通常使用金属制品镊子(植物组织解剖用小的尖头镊子，继代培养中的转管操作使用枪型镊子，16-22cm长)剪刀(不锈钢医用剪刀，做取材和切段转移繁殖，14-22cm长)解剖刀(用于组织切段，多用短柄可换刀片的医用不锈钢解剖刀),金属用具,3.塑料用具各种封口膜、盖、塑料盘及其它塑料用品,
