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1、,重组人血小板生成素（rhTPO）的研究与开发,指导教师：胡昌华 教授辅助指导：赵燕莉 学姐搜集整理资料：孙振鹏 赵丽丽翻译文献、校稿：赵娜薇 李娅男PPT动画制作：赵振国,关于血小板,概述 大量存在于血液中无核盘状小细胞（直径约3m）。其生成受血液中的血小板生成素(TPO)调节。成年人血液中血小板数量为1030万/mm3。作用功能 促进止血;加速凝血;维护毛细血管壁完整性。,血小板减少的原因及症状,血小板生成减少：遗传性 获得性血小板破坏增加：非免疫性 免疫性其他：脾亢、出血等。,反复化疗更容易导致血小板减少,传统治疗方法血小板输注,存在的弊端主要有：1）同种异体免疫反应：导致无效性血小板输
2、注；2）输血感染；3）过敏反应；4）来源困难，价格昂贵等。,因此，新型治疗血小板减少症的特效药物的研发具有较为可观的经济价值和深远的社会影响,主要内容,关于TPO和rhTPO研究历史和现状主要生产方法及技术参与竞争的主要公司目前存在问题及改进前景与展望,关于TPO与rhTPO,重组人血小板生成素（rhTPO）是采用现代基因工程技术，以原核或真核细胞为宿主进行分泌表达的全长糖基化基因工程蛋白类物质，具有与内源性TPO相似的特异性升高血小板数的药理作用。,巨核细胞,TPO,血小板生成素（内源性细胞因子）,与受体结合,刺激,增殖 分化 成熟,血小板,TPO 主要在肝脏合成；332个Aa、95kD的糖
3、蛋白；两个结构域：受体结合结构域；富糖结构域。,TPO受体（c-Mpl）含有2个细胞因子受体同源结构。TPO与末端CRM结合、激活c-Mpl、启动细胞内信号转导,研究历史和现状,1958年，Kelemen等人发现在血小板减少症病人血浆中，存在一种可促进巨核细胞成熟及血小板生成的物质并命名为血小板生成素(TPO)。,1994年，科学家采用反相及常规生物技术，从多个样本中纯化得TPO。,第1代TPO分子包括rhTPO、聚乙二醇化重组人巨核细胞生长衍生因子(PEG-rHuMGDF)。但由于临床试验中不良反应的存在,第1代TPO分子在英美等发达国家已停止了研究，在国内得到一定程度的发展。,进入21世纪
4、以来，第2代TPO以其可口服给药，且相比第一代在免疫原性方面有所改善等优点被广泛研究。主要包括3类:TPO肽类模拟物、TPO非肽类模拟物和TPO激动剂抗体。它们以不同方式结合并激动TPO受体从而发挥生物学效应，部分正进行临床试验。,主要方法和技术路线,1 大肠杆菌表达系统,2 酵母细胞表达系统,3 CHO表达系统,(一)大肠杆菌表达系统,概述 通过构建GST-TPO融合蛋白表达质粒，在tac启动子作用下实现了在TPO在原核细胞中的高效表达，再经GST亲和色谱及凝血酶酶切得到TPO目的产物。评价具有刺激巨核细胞和血小板生成的生物活性；表达水平较低；产物分离纯化技术尚未成熟。,（二）酵母细胞表达系
5、统,概述 以人胎肝cDNA文库为模板，通过PCR引物设计、扩增使毕赤酵母信号肽序列取代TPO固有序列,经电转化筛获重组酵母,并用甲醇进行诱导表达。评价目的蛋白产量有待于提高；产物的分离纯化工艺尚不成熟；表达产物生物学活性不稳定等。,（三）CHO表达系统,概述 将含有编码人血小板生成素核苷酸序列的CHO细胞接种在细胞罐内扩增培养得到高表达收获液。然后通过一系列纯化工艺，获得高纯度和生物活性的rhTPO。评价适于rhTPO的大规模生产；终产物纯度较高；分离纯化表达产物的步骤过于繁琐。,方法与技术路线（上游阶段）,方法与技术路线（下游阶段）,GO,目的基因的获得（PCR）,1.模板变性 双链 DNA
6、 模板在 95C 变性为单链 DNA。2.引物退火 引物与单链 DNA 互补并退火。3.延伸反应 耐热的 DNA 聚合酶催化子链的合成。,Back,组建重组质粒,B质粒,A质粒,pDC-T质粒,王志云，等，西安医科大学学报，第22卷，第六期，2001,Back,构建工程细胞,用磷酸钙介导的转染法进行转染,Back,磷酸钙介导的转染法,Back,转化细胞的筛选,王志云，等，西安医科大学学报，第22卷，第六期，2001,Back,目的基因的扩增,王志云，等，西安医科大学学报，第22卷，第六期，2001,Back,转染细胞目的基因的检测,王志云，等，西安医科大学学报，第22卷，第六期，2001,Ba
7、ck,培养工程细胞株,Step,Step,Back,目的产物的分离纯化,经过SDS-PAGE、HPLC检测证明，种产品纯度。,浓缩脱盐,阴离子交换层析,疏水层析,凝胶过滤层析,Back,配制药品制剂,Back,质量控制,Back,沈阳三生制药股份有限公司历经近10年的潜心研发得出的药物“特比澳”（入选至国家“863”计划、“十五”重大科技项目）曾于2005年5月获得国家一类新药证书，成为世界上第一个完成rhTPO临床试验并被批准上市的基因工程药物。,rhTPO商品化药物的出现,参与竞争的主要公司（包括试验阶段的同类产品）,国内上市的治疗血小板减少症的药物（包括非TPO类）,特比澳（rhTPO）
8、与吉巨芬（IL-11）两种药物的细化对比,特比澳耐受性试验-单次给药,参考文献 中国医学科学院学报 2004 26（4）:437-41,减少血小板数恢复所需天数,目前存在的问题及改进,已实现商品化的药物（特比澳）存在的问题,偶有发热、肌肉酸痛等；生产工艺复杂；终产物价格昂贵，多数阶层患者难以承受。,仍处于实验室阶段的研究成果存在的问题,第1代TPO相关分子聚乙二醇化重组人巨核细胞生长衍生因子，具有免疫原性，故而终止试验。优化改进 分离提取工艺方面；生物活性的保证；适当降低所需成本；最优化治疗剂量、疗程的探讨。,前景与展望,葛兰素史克公司正在研发的产品第二代TPO分子Promacta，是口服非肽
9、类血小板生成素受体激动剂，临床前和前两期临床研究显示本品可升高血小板数目。其他第2代TPO分子尚处于临床前试验阶段（如：美国安进公司AMG 531）,需要更多的研究证实其疗效。随着研究的不断进行和深入，相信不久即会有新一代的TPO相关分子正式进入临床应用。我们相信，随着生物技术各相关学科日新月异的逐步展，人类对TPO的认识会更深入更全面，对TPO类药物的应用也必将更广泛。,在此次团结协作 搜集整理资料过程中 我们收获很多,感谢胡老师！,感谢赵燕莉学姐！,谢谢观看,MajpjMVcyzj21HLfrvy96dv02lPPfYgxUS7IYmZkyEmZ0kGeYZS3bpLCkYH1lt4EK7
10、CxmUX3ijoYSOer7ZuaVWYgz4EpZrUirVpMzzvNtf1XZw5oswSXOtFaejnOcmfE1lZgnN1RSXg8wLCG8CVQ3XPJMvodPFWcpiYJgZazNSEPNIaklYSu7qSd1UpaxmZDlpN9zW7kljfsLCLi26Yv109ffbnDH8LbUN1G6ACURQ39eG12KHL9tXsZ1jzgoCK8g1kuNOh5eFvcmVT5ZYVQt9zk3rp3qLnf02FovEXxVRxjCcFRNppiJljNiOuk6fONnyX7fyGg7sXZ49BmCN5oy9VesHpKzdjTKwjrkCEQCFDehV
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