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1、鼠类抗药性的监测方法与治理技术,天马行空官方博客：http:/;QQ:1318241189,一、抗凝血灭鼠剂的作用机理及发展动态,二、鼠类抗药性的发生机制,三、我国鼠类抗药性的基本情况,四、抗药性检测方法,五、鼠类抗药性的应对策略与技术措施,天马行空官方博客：http:/;QQ:1318241189,一、抗凝血灭鼠剂的发展动态,抗凝血灭鼠剂(Anticoagulant rodenticides)是指一类慢性或多剂量灭鼠剂(Chronic or multipie-dose rodenticides).这类药剂在大多数国家得到推广应用，使用量约占杀鼠剂用量的95，鼠害损失率减少75以上.,天马行空
2、官方博客：http:/;QQ:1318241189,抗凝血灭鼠剂的发展历史,20世纪初，在美国和加拿大的牛出现一种奇怪的疾病，其特点是大出血，常见于创伤之后.,1943年，鉴定出这种致出血物质是双香豆素（Dicoumarin），并合成多种双香豆素同系物，最初用于血栓栓塞性疾病的防治.,1948年,首次用双香豆素灭鼠并获得成功（OConnor）.1950年,合成并推荐用香豆素衍生物中的42号化合物(Warfarin)作为灭鼠剂(Krieger).,1953年，美国野生动物研究所对鼠完进行了158次现场试验，肯定了它的灭鼠效果，并作为灭鼠剂推广使用.,至此，开创了一个以抗凝血灭鼠剂为主要手段的化学
3、灭鼠新时代，开发出一系列抗凝血灭鼠剂并得到推广应用.,1956年，美国渔业和野生动物研究所报告用10杀鼠酮毒粉可以控制养殖场鼠患，并对禽类较安全.,抗凝血灭鼠剂的分类,按化学结构划分,1.茚满二酮类：,2.香豆素类：,敌鼠(Diphacinone)、氯敌鼠(Chlorophacinone)、鼠完(Pindone)、杀鼠酮(Valone),杀鼠灵(Warfarin)、杀鼠迷(Cumatetralyl)、比猫灵(Coumachlor)、克灭鼠(Cumafuryl)、鼠得克(Difenacoum)、溴敌隆(Bromadiolone)、大隆(Brodifacoum).,按对抗性鼠的作用划分,1.第一代
4、抗凝血灭鼠剂：急性毒力小，对抗性鼠无效.,2.第二代抗凝血灭鼠剂：急性毒力大，对抗性鼠有效.,敌鼠、氯敌鼠、鼠完、杀鼠酮、杀鼠灵、杀鼠迷、比猫灵、克灭鼠,鼠得克、溴敌隆、大隆 急性毒力分别是杀鼠灵的103倍、165倍和715倍.慢性毒力：分别为5倍、相近和14倍.,抗凝血灭鼠剂的作用机理,1.损害毛细血管，使血管壁的通透性增加，导致内出血；,2.对抗维生素k，切断维生素k1的循环利用,干扰凝血酶原等凝血因子合成，降低血液的凝固能力。,维生素K循环和抗凝血剂的作用,VK环氧化物还原酶,VK1环氧化物,凝血因子,羧化酶,抗凝血剂,VK醌,VK还原酶,VK1氢醌,DT硫辛酰胺脱氢酶,抗凝血剂,抗凝血
5、灭鼠剂的作用特点,1.作用缓慢，症状轻。投饵后67天为死亡高峰；2.适口性和灭效明显优于急性灭鼠剂；3.慢性毒力比急性毒力大10倍.采用低浓度的毒饵多剂量技术(Multipie dose technique)更能发挥抗凝血剂的毒杀作用；4.使用浓度低，对非靶动物较为安全；5.有特效的解毒剂（维生素K1）；6.消耗的毒饵量较多.,二、鼠类抗药性的发生机制,1958年，首次在英国苏格兰的一家农场发现抗药性，有90褐家鼠不能用杀鼠灵毒饵杀死。1960年，在威尔士与英格兰交界处发现了抗药性褐家鼠种群。调查结果证明，抗性种群的分布区每年以4.6公里的速度向外扩展。,1962年在丹麦、1966年在荷兰，7
6、0年代在美国、法国、澳大利亚等都发现了抗杀鼠灵褐家鼠。50年代末至70年代初，西欧和北美在发现褐家鼠抗药性的同时，也报道了黄胸鼠和小家鼠的抗药性。中国20世纪70年代末开始推广使用抗凝血灭鼠剂，但到90年代初期在上海、洛阳、沈阳等用药时间较长的地区已有抗药性产生的报道，抗性率在4.0%一20.0%之间。,抗凝血剂饱和处理,鼠类种群,拒食类群,抗药类群,敏感类群,存活,死亡,鼠类抗药性的方式,行为抗性,由于人类不当的灭鼠行为影响，如基饵选择不当、基饵变质、投饵量长期不足，以及死鼠尸体的警示作用等.,使得部分鼠类变得异常机警，对毒饵的适口性显著下降甚至产生拒食现象，导致害鼠对药物食入量不足而不能杀
7、灭害鼠。,生理抗性,鼠类摄入敏感鼠种的致死剂量时，无法被抗凝血剂杀死。这部分鼠类被认定为抗性鼠。造成这种抗凝血剂低效的原因是由于这些鼠种具有可遗传的并能相当大程度上降低鼠类对抗凝血剂敏感性的特性.,广州市黄毛鼠抗性发生情况(花都区炭步镇,2007.12),存活鼠中不同个体分布情况(花都区,2007.12),行为抗性鼠对抗凝血灭鼠剂的敏感情况,维生素K环氧化物还原酶(VKOR)的活性改变 抗性鼠体内参与VK循环利用和凝血酶原复合物形成的酶（主要是VKOR）发生变异，不受抗凝血剂抑制。,鼠类抗药性的生化、遗传基础,鼠类产生抗药性的生化机理,P450细胞色素氧化还原酶的活性改变 抗性鼠抑制了P450
8、细胞色素氧化还原酶中CYP3A2mRNA的表达，引起P450细胞色素氧化还原酶蛋白构像的改变，导致其解毒酶活性的降低，从而影响到解毒代谢（Sugano，2001）.,VK环氧化物还原酶复合物亚单位1(VKORC1)基因突变，导致鼠类凝血功能降低.,Mutations in VKORC1 cause warfarin resistance and multiple coagulation factor deficiency type 2,2004,nature,427,537-541.Identification of the gene for vitamin K epoxide reducta
9、se,2004,nature,427,541-544.,鼠类产生抗药性的遗传基础,通过基因芯片和PCR等方法，在广东江门市抗性黄毛鼠中发现了一种新的抗性突变位点R58G.,抗性个体的突变位点：第58位精氨酸（Arg）突变成甘氨酸（Gly），导致酶的活性降低，从而引起抗性的发生.,其它的突变位点：第35位精氨酸(Arg)突变成半胱氨酸（Cys）和编码41号氨基酸和96号氨基酸的两个单核苷酸突变，这两个突变并没导致氨基酸的突变。,在维生素K环氧化物还原酶（VKORC1）的蛋白拓扑结构中，第57位丝氨酸（Ser57）是酶的重要作用位点.,VKORC1膜的拓扑结构,我国在20世纪70年代末开始推广抗凝
10、血灭鼠剂，90年代初期上海、洛阳、沈阳等用药时间较长的地区已有产生抗药性的报道，抗性率4.0%一20.0%.,全国鼠类抗药性监测协作组经过10多年的调查监测，发现在连续使用抗凝血灭鼠剂超过6年的地区，家栖鼠对杀鼠灵等灭鼠剂存在着不同程度的抗药性和交叉抗性。,三、我国鼠类抗药性的基本情况,湖南、江苏等省2000年对家栖鼠的抗药性进行调查，褐家鼠已产生抗药性个体。,1990年在广州市家鼠中未发现抗性鼠，2003年监测结果表明广州市黄胸鼠和小家鼠已形成抗药性种群，抗性率分别为45.2和27.8，褐家鼠产生了抗药性个体。,湖南长沙发现黄胸鼠对溴敌隆形成抗性种群，抗性发生率高达70%。,深圳(1998年
11、)、湛江(1999年)的抗药性调查均已显示鼠类对抗凝血灭鼠剂的敏感性有所下降，尤其是湛江地区的黄胸鼠已出现较严重的抗药性(抗性率33.3%).,我国褐家鼠对第一代抗凝血剂的抗性发生状况(2001),已抗性,未抗性,已抗性,未抗性,我国黄胸鼠对第一代抗凝血剂的抗性发生状况(2001),已抗性,未抗性,我国小家鼠对第一代抗凝血剂的抗性发生状况(2001),广东省农田鼠类抗药性监测地点,农田害鼠对第一代抗凝血剂的抗药性监测结果,致死期食毒法(LFP)法 血凝反应法(BCR法)基因检测法,四、鼠类抗药性检测方法,致死期食毒法(LFP法),抗药性测定的标准药物：杀鼠灵毒饵.,杀鼠灵标准品：纯度99，熔点
12、159162.,食毒期：WHO推荐的98%或99%敏感靶标鼠种的食毒期(LPF98/LPF99)的95%置信上限取整数天。,研究不同鼠种对抗凝血灭鼠剂的敏感基线并确定LPF99，是采用LFP法检测抗性的重要基础,褐家鼠0.005黄胸鼠0.05小家鼠0.05%,黄毛鼠0.002；板齿鼠0.002；黑线姬鼠0.005；长爪沙鼠0.005；大足鼠0.025%；达乌尔黄鼠0.05。,毒饵浓度：,靶鼠室内单笼饲养适应1周，选择成年、健康、非孕个体进行试验。,用食盒供给无毒诱饵2d，第2d吃饵不及全部试鼠平均摄食量20的个体淘汰。,褐家鼠饲喂6d标准毒饵、黄胸鼠9d、小家鼠11d、黄毛鼠9d，每天称毒饵消
13、耗量，第1天吃毒饵不及前一天无毒饵的10的个体淘汰。,攻毒期结束后，试鼠正常饲养观察：褐家鼠20d、黄胸鼠25d、黄毛鼠20d、小家鼠30d。试验期间产仔或无出血体征的死鼠淘汰。,检测步骤,抗药性个体:(1)试验期结束仍存活；(2)存活者摄药剂量(mg/kg)达到：褐家鼠12、黄胸鼠143、小家鼠338、黄毛鼠10.,抗药性种群:(1)试验样本至少20只，抗性发生率达15；(2)样本的总平均摄药剂量(mg/kg)达到：褐家 鼠12、黄胸鼠143、小家鼠338、黄毛鼠10.,抗药性判别标准,技术简单(笼养，毒饵给药)；耗时耗力，工作量大；有一定误差.野外条件下有的害鼠有一定的耐受性或对毒饵的选择
14、作用而存活下来，但是当处于实验检测时却有可能死掉而被归于敏感鼠；缺乏人道.,致死期食毒法的特点,抗凝血剂的作用靶标是维生素k环氧化还原酶（VKOR），通过阻断VK的循环利用，使凝血因子合成受阻，无法完成正常的凝血过程而发生致命的大出血。VKOR活动度是检测鼠类抗药性的主要指标。,血凝反应法(BCR法),BCR法的技术原理,抗凝血剂对VKOR活动度的影响采用血凝时间长短来衡量,转换成凝血活度(PCA)或INR值。,鼠类摄入抗凝血剂后，通过抽取血样检测凝血活度(PCA)或INR值，计算抗凝血剂对VKOR活动度的抑制率，即可区分该鼠的抗药性情况。,C.Bailey等发展了一种微量血样本BCR法，通过
15、从尾部取血大大减小了对鼠的伤害及测试成本.,杀鼠灵抗性鼠标准:VKOR抑制率低于82.5%(Martin等,1979)；溴敌隆和鼠得克抗性鼠个体标准：VKOR抑制率低于87.5%(Pelz等,1993)；抗性种群的标准：VKOR活动度大于敏感种群的活动度17.5%.,抗性鼠、抗性种群的划分标准,测试抗凝血药物对靶标鼠种的BCR基线.,BCR法的检测路线,靶标鼠摄入抗凝血剂前后抽取血样.,检测抗凝血剂对靶标鼠的凝血指标.,计算抗凝血剂对靶标鼠VKOR活动度的抑制率，评价其抗性状况.,增加了检测的可重复性和准确性。BCR法不受动物取食行为影响，试鼠也可以饲养后再进行确认检测.快速而且合乎人道。便于
16、进行地域间、药物间和种间的不同抗性水平的比较.是一种相对成熟的抗性检测方法。BCR法对杀鼠灵、鼠得克、溴敌隆等都被证明是可行的.花费大。BCR法需要抗凝血剂处理及取血样进行检测.,BCR法的特点,基因检测法,基因检测法通过检测抗凝血剂抗性控制基因的突变情况来判别抗性发生状况，是目前最为准确和快捷的检测方法.,从鼠上取一小块组织甚至排泄物得到其DNA，就可以通过检测抗性突变基因来判别抗性.,找到了褐家鼠和小家鼠抗性的一些VKOR基因突变位点，实现了部分地区小家鼠、褐家鼠的杀鼠灵抗性基因检测（Rost等，2004）。,开展基因检测抗性的前提是要明确抗性鼠基因的特异性突变位点。,已发现的鼠类抗性突变
17、基因(from Pelz et al.2005),Arg58Gly,初步明确了广东省江门市黄毛鼠对杀鼠灵抗性的特异性基因突变位点：第58位精氨酸（Arg）突变成甘氨酸（Gly）.,五、鼠类抗药性的应对策略与技术措施,树立持续控害理念，开展综合治理.,开展抗性检测技术研究与发生动态监测.,科学灭鼠，延缓抗性的产生速度.,合理用药，防止抗药性的进一步扩散.,生态治理,鼠情监测,提高死亡率,化学灭鼠,器械灭鼠,天敌控鼠,不育控制,控制鼠密度,降低出生率,鼠害持续治理技术模式,加强监测，健全鼠情监测网络.,延缓鼠类产生抗药性的化学灭鼠对策与技术,应用防治阈值指导灭鼠行动，在必要时才开展化学灭鼠.,采用
18、一役达标的灭鼠对策，在防治适期集中人力和药物进行全面灭鼠.,加强灭鼠的组织领导，开展“五统一”灭鼠行动.,不同灭鼠次数对害鼠密度的控制效果,慎用第二代抗凝血灭鼠剂，未产生抗药性的地区建议继续使用第一代抗凝血剂灭鼠.,宜采用低浓度、饱和投放的方式进行灭鼠.,可利用抗凝血增效剂来降低杀鼠剂的使用浓度，对提高灭效、延缓行为抗性和维护生态安全有重要作用.,采用毒饵站和前饵技术，提高毒饵的取食率，降低鼠类的行为抗性.,A处理：一次饱和投放；B处理：每天更换毒饵,投饵方式对毒饵取食率的影响,采用栖息地灭鼠技术提高防治效果.,鼠类产生抗性后的防治对策,在停止抗凝血剂淘汰的情况下,抗性鼠易患维生素K缺乏症，生
19、存能力低，竞争不过敏感鼠。,在抗凝血剂的选择压力下，抗性鼠才能胜过敏感鼠生存下来，但其生育力有所下降。,在发生抗药性的地区只要停止使用这类抗凝血剂，鼠类抗药性问题可得到一定程度的缓解。,探索一些非化学毒杀的防治方法,解决鼠类抗药性的一些设想,及时研究鼠类抗药性的检测技术,调查主要害鼠的抗药性及其区域性发生动态,在第一代抗凝血剂抗药性发生严重的地区，应暂停使用该类杀鼠剂,改用第二代抗凝血剂 使用效果较好的其它灭鼠剂，但要确保安全 抗性消失后，应继续使用第一代抗凝血剂,在产生抗药性个体但未有抗性种群的地区，可继续使用第一代抗凝血剂,不同化学结构的抗凝血剂轮换使用 改变以往不合理的做好，开展科学灭鼠 协调使用生态调控和其它控鼠技术措施,鼠类抗性治理的成功范例,1999年，湛江市区黄胸鼠抗性率33.33,2000年起，在抗性严重的地区采用溴敌隆灭鼠,2003年，黄胸鼠对第一代抗凝血剂表现为敏感,2004，杀鼠迷与敌鼠钠盐轮换使用,结 语,1.在鼠害防控工作中，应改变单一依靠化学灭鼠的现状，研究实用、安全、环保的其它控鼠措施并推广使用，确保鼠害的可持续控制。,2.抗性行为是一种无法避免的生物自我保护作用，其作用机制与治理技术有待进一步研究。首要任务是要采用科学措施，延缓抗性产生的速度.而在已产生抗性的区域，应及时控制抗性率的扩展，甚至使抗性率逐渐消减。,
