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1、,第七章 饲料快速分析技术,内 容,显微镜检技术近红外光谱技术,显微镜检技术,原理 饲料显微检测是以动植物形态学、组织细胞学为基础，将显微镜下所见物质的形态特征、物化特点、物理性状与实际使用的饲料原料应有的特征进行对比分析的一种鉴别方法。常用的显微镜检技术 体视显微镜检技术 生物显微镜检技术,饲料显微检测的主要特点,快速、简便、准确。不需要大型的仪器设备，也不需要复杂的检前准备饲料的显微镜检不仅可作定性分析，而且可作定量分析，可对原料成分的纯度进行分析。通过饲料显微检测可鉴别伪劣商品，控制饲料加工，贮藏品质，弥补化学分析之不足。,饲料显微检测所需设备,体视显微镜 带有宽视野目镜和物镜，放大范围
2、为1045倍。生物显微镜 放大倍数为401 000倍其 他 离心机:1 2001 500 rpm;烘箱;抽滤器;分析天平 分级筛：孔径为2.00，0.84和0.42 mm。电热板，载玻片，盖玻片，探针，镊子（最好是修理钟表用的），镜头纸，滤纸，漏斗，滴管，烧杯，试管，小刷子，瓷盘等。,饲料显微检测的基本步骤,体视显微镜检测 生物显微镜检测,近红外光谱检测技术,NIR的特点及发展状况分析原理定标方程的建立和预测NIR的应用,NIR的特点及发展状况,为什么采用近红外？,很少或完全不需样品制备完全的无损分析分析过程不需化学试剂友好的操作界面分析快速-扫描时间不到一分钟可靠的仪器制造高分析精确度及准确
3、度,经典化学分析控制产品质量的缺陷,测试时间长,多个指标的全部给出需要几天的时间投资大（需多台精密分析仪器）日常消耗多（试剂，水，电.）环境污染,采用经典化学分析法所需时间,水分 4小时灰份 3小时粗蛋白 3小时粗脂肪 3小时总淀粉 10小时粗纤维 8小时,近红外技术的发展历史,1800年Herschel第一次发现NIR区域19世纪末，Abney 和Festing在NIR短波区域首次记录了有机化合物的近红外光谱，1928年，Brachet测得第一张高分辨的NIR图，并对有关基团的光谱特征进行解释。由于缺乏可靠的仪器基础，50年代以前，NIR的研究工作只局限在为数不多的几个实验室中，很少有实际应
4、用。20世纪50年代中期，Kaye首先研制出能准确得到NIR光谱的仪器，一些公司相继开发了商品化的仪器。,Norrise等人在NIR的应用方面做了大量的工作，如他们采用NIR测量了农副产品中的水分、油脂及蛋白含量，同时NIR也被用于有机化学、聚合物及药物化学等领域。直到今日，农副产品及食品的质量分析仍然是NIR应用最多的领域。60年代中期，（中）近红外光谱商品化仪器出现，及其在化合物结构表征中所起的巨大作用，但对NIR在分析测试中表现的灵敏度低、抗干扰性差的弱点，使人们淡漠了该技术的应用。,在此后约20年中，NIR技术几乎处于一种徘徊不前的状态，Wetzel称NIR在这段时期是光谱技术中的沉睡
5、者。80年代以来，由于计算机技术的发展和化学计量学的应用，高性能的计算机与准确、合理的计量学方法相结合，使光谱工作者能在较短的时间内完成大量的光谱数据的处理，NIR分析得到迅速发展,1988年建立了国际近红外光谱协会（CNIRS），该协会的北美分会对NIR的文献（1905-1990）做了全面的汇编（CBIBL）90年代初，近红外研究及应用的专门杂志J.Near Infrared Spectroscopy 和Near Infrared News 分别创刊。1987年举办的第一届NIR研究与应用的国际会议，每次会议都出版了相应的文集，登摘了大量涉及NIR仪器、计量学方法研究及应用方面的文章。除此之
6、外，光谱分析杂志，如Applied Spectroscopy,美国Analytical Chemistry 及其它一些专业性杂志和专利上都有大量的NIR基础研究及应用的文章,近红外技术的历史,第一代近红外光谱仪进入市场-漫反射 第二代近红外光谱仪进入市场-电子部件更加 稳定，光学技术进一步提高 第三代近红外仪问世-带微处理器或计算机 第四代近红外仪问世-光栅型近红外光谱仪 第五代傅立叶型近红外进入市场 我国在NIR技术的研究及应用方面起步较晚，但近年来在仪器的研制、软件开发、基础研究及应用研究方面已取得了可喜的进展，在有些领域已进入实质应用阶段，并创造了可观的经济效益。NIR技术在我国饲料工业
7、的应用刚刚起步，越来越多受到重视。可以预见，随着人们对NIR技术认识的逐步深入，其应用及发展将有广阔的前景,滤光片型近红外光谱仪,分为固定滤光片和可调滤光片两种形式 由光源发出的光经过滤光片得到一定带宽的单色光，通过样品池与样品作用后由检测器检测优点：设计简单、成本低、光通量大、信号记录快、坚固耐用；缺点：只能在单一波长下测定，灵活性较差，如样品基体变化，往往会引起较大的测量误差。,扫描型近红外光谱仪,分光元件可以是棱镜或光栅 通过光栅的转动，使单色光按波长长短依次通过测样器件，进入检测器检测。根据样品形态不同，可选择不同的测样器件进行透射或漫反射分析 优点：可进行全谱扫描，分辨率较高，仪器价
8、格适中，便于维护；缺点：光栅的机械轴长时间使用容易磨损，影响波长的精度和重现性，一般抗振性较差,傅里叶变换近红外光谱仪,主要光学元件是Michel-son干涉仪光源发出的光分成两束后，造成一定的光程差，再使之复合以产生干涉，所得的干涉图函数包含了光源的全部频率和强度信息，用计算机将样品干涉图函数及光源干涉图函数经傅里叶变换为强度按频率分布图，两者的比值即样品的近红外谱图。优点：扫描速度快、波长精度高、分辨率好，短时间内即可进行多次扫描，可使信号做累加处理，光能利用率高、输出能量大，仪器的信噪比和测定灵敏度较高，可对样品中的微量成分进行分析缺点：干涉仪中有移动性部件，需要较稳定的工作环境,近红外
9、定量分析目前所获得的国际认可,1975年加拿大谷物委员会正式确定NIR为该国官方 的蛋白质分析方法1979年NIR成为官方分析油料中单葡萄糖苷的快速 测定方法1983年成为快速测定油料中不饱和脂肪酸的官方分 析方法1984 美国公职分析家学会(AOAC)989.03:NIR成为分析饲料中蛋白，酸性洗涤纤维，中性 洗涤纤维 的标准方法1985年国际谷物技术协会采用NIR技术测定蛋白,近红外技术在我国饲料研究与应用进展,七五期间，近红外定标软件的研制列入国家攻关计划。在此期间以中国农科院畜牧研究所为首，全国近20家研究所联合完成了饲料用玉米等九个能量饲料大豆粕等4个蛋白饲料苜蓿粉等7个粗饲料蛋鸡配
10、合料干物质，粗蛋白，粗纤维，和灰分组分的定标数据库建立和定量分析工作,近红外技术在我国的研究与应用进展,6个饲料的消化能和代谢能含量分析大麦等4个饲料原料的氨基酸分析米糠饼等6个饲料的植酸磷分析饲料添加剂中喹乙醇分析的定标工作 这些工作为NIR技术在我国农业上的应用提供了大量的基础数据,NIR技术已正式列入我国饲料国标,GB/T 18868-2002 饲料中水分、粗蛋白、粗纤维、粗脂肪、赖氨酸、蛋氨酸、快速测定近红外光谱法Method for determination of moisture,crude protein,crude fiber,crude fat,lysine and met
11、hinione,近红外光谱分析原理,Near Infrared Spectroscopy,NIR,近红外光谱方法（NIRS）利用有机物中含有C-H、N-H、O-H等化学键的泛频振动或转动，以漫反射方式获得在近红外区的吸收光谱，通过主成分分析、偏最小二乘法、人工神经网等现代化学计量学的手段，建立物质光谱与待测成分含量间的线性或非线性模型，从而实现用物质近红外光谱信息对待测成分含量的快速计算,近红外光谱的波长范围是780-2500 nm，通常又将这个范围划分为近红外短波区（780-1100 nm，又称Herschel光谱区）和近红外长波区域（1100-2500 nm）。,近红外光谱波长范围,紫外,
12、可见,近红外,中红外,2500,4,000,官能团定性分析分子光谱,成分定量分析分子光谱,表观颜色分析,定量分析分子光谱,800,14,285,400,25,000,200,50,000,25,000 nm,400cm-1,伸缩振动,弯曲 振动(1),弯曲振动(2),脂肪在NIR的对应基础,蛋白质在NIR的对应基础,糖在NIR光谱的对应基础,典型的近红外吸收,近红外吸收重要的波长,基频以外的其他振动能级跃迁产生的红外吸收频率统称为倍频,近红外吸收重要的波长,WATER,OIL,PROTEIN,STARCH,700,1000,1300,1600,1900,2200,2500,波长(纳米),0,0
13、.2,0.4,0.6,0.8,1,吸光度(Log 1/R),三级倍频吸收带,二级倍频吸收带,一级倍频吸收带,合频吸收带,尼龙纤维样品的近红外光谱,NIRS仪器,光源、分光系统样品池检测器数据处理,NIRS仪器类型,滤光片型近红外光谱仪 扫描型近红外光谱仪(棱镜或光栅)傅里叶变换近红外光谱仪(Michel-son干涉仪)固定光路多通道检测近红外光谱仪,近红外检测技术分类,NIR=近红外漫反射技术 Near Infrared ReflectanceNIT=近红外透射技术 Near Infrared Transmittance,近红外透射/漫反射技术,透射技术(NIT),漫反射技术(NIR),ITE
14、C169A,ITEC168A,Light source,Light source,Detector,Detector,漫反射,检测器,检测器,入射到样品的一部分光能被样品吸收。漫反射测量 如果样品是固体，采用漫反射检测器，没有被吸收的光将被反射到检测器进行检测透射测量如果样品是澄清的液体或薄膜，则采用透射光检测器，入射光透过样品后，没有被吸收的光进入检测器检测。通过对参比的扫描来，软件知道不同波长处光源发出的能量有多少，通过对样品的扫描，软件知道在不同波长处返回的能量有多少。由此软件将对不同波长处能量的衰减(即样品的吸收）作图，即可得到样品的吸收光谱。,采用漫反射技术对固体样品进行分析/液体样
15、品采用透射检测技术,磨粉玉米的近红外漫反射扫描光谱,甘蔗汁分析采用透射技术,液体油的近红外光谱,5.3 定标方程的建立和应用,有关近红外技术定标,采用近红外测定某一产品的成分，首先需要对这个产品的各种成分定标。定标建立将采用样品的扫描数据，然后和某一成分 的传统分析方法数据相关连(通常是化学分析法数 据）。一旦某成分定标建立，就可以分析未知样品中此成 分的浓度，分析时间只需40秒。,近红外技术的定标过程图例,比尔定律,吸光度与样品浓度间的关系通过比尔定律描述：A=abc 在这里:A=某一波长的吸光度 a=摩尔吸光系数 b=吸收介质的光程 c=样品浓度,97%OH,47%,57%,85%,68%
16、,77%,吸光度大小与样品浓度成正比.,C=B0+B1X1,Concentration%=0.222+-1065.8*Abs at 2064 C B0 B1 X1,MHA样本的近红外反射光谱,MHA样本的二阶导数光谱,L赖氨酸盐酸盐样本的近红外反射光谱,L赖氨酸盐酸盐样本的二阶导数光谱,近红外定量分析方法,常规分析,模型验证,散射校正,定标回归技术建立定标模型,样品收集,线性定标模型Cnirs=B0+B1*A1+B2*A2+.+Bk*Ak,建立近红外分析方法,建立近红外定量模型的最终目标是一个长期稳 定的和可预测的模型。,建立近红外分析方法,定标样品收集样品数目-根据检测成分的数目产品本身的变
17、异程度而定样品浓度的分布状态定标系列必须包含样品变化 经常收集样品(不是只在一天)结合不同的过程变化(不同的供应商，季节，颗粒度等)浓度范围需5-20倍于标准方法的标准偏差,标准方法分析验证样品集类似于定标样品集样品收集 包含相同的变化如果样品许可，可保存高，中，低浓度三种样品作为“标准样”定期分析，用于仪器定标检查的控制样,近红外定标方程的开发和扩展所需湿化学标准值,在做湿化学分析前，须先进行样品扫描扫描过的样品（同一份样）送交实验室进行湿化学分析.送交实验室样品必需放置于密封的容器或封口样品袋中，以防止水份和挥发物的损失。样品需及时分析。所使用的实验室分析方法需官方认可的标准方法,如果分析
18、样品需要制备（研磨，萃取等），必须在实验室报告中注明。如果样品制备需要磨，那么样品磨的类型和筛的尺寸有记录。报告每一个方法和产品类型的实验室分析方法的误差NIR是二手方法，需要用传统方法结果校正近红外分析准确度无论如何也不会比对定标 样品集传统分析分析的准确度高.,影响近红外定标准确性的主要因素,参与定标的样品量不足，不具代表性定标样品几乎一致造成定标不具代表性样品近红外扫描数据误差定标所使用的实验室数据分析不准确非线性因素对定标的影响,NIR-统计术语解释,N 定标样品个数Mean 定标样品集平均浓度SEC 定标标准偏差RSQ,Correlation 定标相关系数SECV交互验证标准偏差1-
19、VR,Correlation交互验证相关系数SEP预测标准偏差,Standard Deviation标准偏差SEP(C)(扣除系统偏差的预测标准偏差）Slope斜率 Bias偏差,WIN ISI II-Scatter plot,近红外技术应用小结,检查仪器是否在正常的工作状态收集样品并获得样品的近红外光谱对样品进行精确的实验室分析并将分析结果输入到光谱文件确定“最好的”样品,利用样品的光谱数据及化学数据建立数学模型来预测样品的成分验正模型(定标方程)的准确性将模型(定标方程)应用于常规分析对模型(定标方程)进行周期性的验正*如需要，应对模型(定标方程)进行升级,NIR的应用,近红外应用领域,乳
20、制品检测谷物饲料&饲草食品加工肉制品酿酒制糖,化学制药聚酯石油化工,近红外技术在农业/食品应用举例,一组玉米样品的近红外光谱,含量48%以上产品具有的主要特征 植物载体型,暴露在空气中很易吸潮，散落少量样品于玻璃培养皿上，很快发生粘附体视显微镜下，氯化胆碱几乎完全附着于稻壳粉，玉米粉等载体表面，呈凹凸不平的不规则透明淡黄褐色团状物，吸潮后表面发亮，且没有晶体或白色的颗粒等其他异物提取液呈浅黄色或亮黄色（主要与使用的载体种类有关），且加碱不浑浊游离氮含量很低，多数不超过0.3%。,胆碱含量严重不足或零样品的主要特征,有两种情况 掺有大量的无机胺盐如氯化胺等或存在大量三甲胺等 掺有大量氯化钠或氯化
21、钙等无机盐类的物质,掺有大量的无机胺盐或存在大量三甲胺等的样品,烘干后颜色明显变深，呈褐色或深褐色提取液颜色为茶褐色或浅茶褐色提取液加碱不浑浊显微镜下有大量的白色晶体或颗粒，能见到部分载体的原形，氯化胆碱含量测定结果多集中在1525之间游离氮含量很高，1.664.01%，如果将这部分氮折算成氯化胆碱的含量，再加上雷氏盐法测定的氯化胆碱含量，二者之和往往超过50,掺有大量氯化钠或氯化钙等无机盐类物质的产品,烘干后颜色变化不大，多呈淡黄色提取液颜色为亮黄色，但多数情况下提取液加碱浑浊体视显微镜下有大量的白色晶体或颗粒，能见到载体的原形，氯化胆碱含量不高，同时游离氮含量也不高，但含有大量的以氯化物形
22、式存在的钙，钾等。,典型NIR图谱识别鉴定,载体空白：稻壳粉，稻壳粉 玉米芯粉，玉米芯粉,植物载体粉剂胆碱合格产品典型NIR图谱,外观呈黄褐色，提取液淡黄色，胆碱含量50以上典型样品,植物载体粉剂胆碱产品典型NIR图谱,不合格产品的典型NIR图谱（1）,外观呈淡黄色，提取液亮黄色，不含氯化胆碱，含大量钙和钾氯化物典型样品,不合格产品的典型NIR图谱（2）,外观呈褐色，提取呈液茶褐色，胆碱含量20.09%，含大量游离无机氮典型样品,从NIR图谱比较可以清楚看到，氯化胆碱在波长2256，2324，2404，2446和2482nm等附近有典型峰，特别是2256nm处，合格的胆碱产品的log(1/R)值应大约在1.2左右。用透射和反射原理，可以分别建立用提取液和固体样品定标预测方程，为氯化胆碱的快速准确定量测定提供了另外一条有效途径。,
