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1、45种氨基酸的临床意义,李丹 Ph.D,AB质谱氨基酸的快速分析,pSerpEtNTau,AsnSerHypGlyGlnEtNAsp,快速分离,高分离度,45种氨基酸的临床意义,第一组份pSer(PhosphoSerine)磷酸丝氨酸 pEtN(Phosphoethanolamine)磷酸乙醇胺Tau()牛磺酸,pSer磷酸丝氨酸,体内磷酸化水平评价,跟胰岛素有关.,pEtN 磷酸乙醇胺,X-linked dominant(X染色体显性遗传病）尿液中的磷酸乙醇胺增高,Tau 牛磺酸,牛磺酸是一种特殊的氨基酸，是人体必不可少的一种营养元素，人体心脏中牛磺酸含量最高。牛磺酸是通过保护心肌而增强心脏
2、功能的。当心肌细胞中钙离子流入量过高时，就会引发冠心病。牛磺酸可以调整心肌细胞中钙离子的量，维持其平衡。牛磺酸与心脏的关系已成为全世界重点研究的课题之一。此外，牛磺酸对肺、肝脏、胃肠等都有保护作用 高压液相方法检测血清牛磺酸水平并与疾病严重程度积分(PASI)进行相关性分析.结果银屑病患者血清牛磺酸水平下降(与健康对照比较,P0.01),并且牛磺酸水平与疾病严重程度呈负相关(R=-0.699,P0.01).结论血清牛磺酸水平可能与寻常性银屑病发病有关.,Asn天门冬酰胺,常规氨基酸,可与其他氨基酸相互转化,第二组份Asn天门冬酰胺 Ser 丝氨酸Hyp 羟基脯氨酸Gly 甘氨酸Gln 谷氨酰胺
3、 Asp 天门冬氨酸,Ser 丝氨酸,97.78130.86mol/L在脂肪和脂肪酸的新陈代谢及肌肉的生长中发挥着作用，因为它有助于免疫血球素和抗体的产生，维持健康的免疫系统也需要丝氨酸。丝氨酸在细胞膜的制造加工、肌肉组织和包围神经细胞的鞘的合成中都发挥着作用。,Hyp 羟基脯氨酸,4.3614.78mol/L羟基脯氨酸和脯氨酸是人体自身合成胶原蛋白的重要氨基酸,Gly 甘氨酸,200.36274.96mol/L高甘氨酸血症，以血、尿、脑脊液中甘氨酸浓度的显著上升为特征，其分为酮症和非酮症型非酮症型高甘氨酸血症，主要症状为智力障碍和惊厥。血及尿中甘氨酸的增加不伴有酮症。甘氨酸裂解酶的缺陷构成了
4、原发性损害，本病为常染色体隐性遗传。酮症型高甘氨酸血症，以周期性出现酮症发作为特征，自生后不久的新生儿期发病。在酮症性酸中毒进展的同时，发生呕吐、嗜睡、肌驰缓、呼吸障碍、惊厥等症状，多在乳儿期死亡。在乳儿期免于死亡者，可有精神、体格发育的迟缓。主要原因是有机酸代谢异常，血中甘氨酸继发升高。,Gln 谷氨酰胺,58.94134.18mol/L常规氨基酸,可与其他氨基酸相互转化,Asp 天门冬氨酸,0.577.47mol/L常规氨基酸,可与其他氨基酸相互转化,第三组份 AEtN乙醇胺Cit 瓜氨酸Sar 肌氨酸Thr 苏氨酸 bAla-丙氨酸 Glu 谷氨酸His组氨酸3MHis 3甲组氨酸Ala
5、丙氨酸Hcit 高瓜氨酸1MHis 1甲组氨酸Asa Argininosuccinic acid 精氨(基)琥珀酸GABA-氨基丁酸,EtN乙醇胺,X-linked dominant(X染色体显性遗传病）尿液中的磷酸乙醇胺增高,Cit Hcit瓜氨酸,高瓜氨酸,瓜氨酸血症citrullinemia 缺乏精氨琥珀酸合成酶，血中瓜氨酸含量剧增，并排入尿中，食用蛋白质后病情严重。,Sar 肌氨酸,高肌氨酸血症，尿、血、脑脊液中可见肌氨酸的增加，应用肌氨酸及二甲基甘氨酸负荷，有多量肌氨酸从尿中排出。推测为肌氨酸脱氢酶的缺陷。本病为常染色体隐性遗传,Thr 苏氨酸,111.3-182.78mol/L 8
6、种必需氨基酸之一人体必需，缺乏时会使人消瘦，甚至死亡。,bAla-丙氨酸,支链有机酸尿症:源于亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的中间产物异戊酰辅酶A、-甲基丁酰辅酶A和异丁酰辅酶A经不同途径进行降解代谢，这些代谢通路的缺陷导致10种代谢性疾病统称为支链有机酸尿症。血尿中可升高,Glu 谷氨酸,13.6144.15mol/L常规氨基酸,可与其他氨基酸相互转化,His组氨酸 1M,3M His,33.7666.36mol/L婴儿期必需氨基酸组氨酸血症，2/3的患者有中度智力障碍，3/4有语言发育迟延。尿氯化高铁在血中组氨酸浓度超过0.5mmol/L时呈阳性。这是因为达到这个浓度时，组氨酸转氨酶发挥作用，使
7、咪唑丙酮酸向尿中排泄。对患者进行组氨酸负荷试验，不见尿刊酸、咪唑丙酸亚氨甲基谷氨酸排泄的增加，但组氨酸分解酶与组氨酸的比例失常。血中谷酰胺、谷氨酸较缺乏，5-羟色胺的血中浓度降低。本症在皮肤及肝脏中证明有组氨酸酶的缺陷。本病大多呈常染色体隐性遗传,1M,3M His 甲基组氨酸,在生物体中以1-甲基化合物和3-甲基化合物存在。1-甲基组氨酸作为鹅肌肽（anserine，-丙氨酰-1-甲基组氨酸）的前体物质大量存在于肌肉中。它是由于S-腺苷酰甲硫氨酸的甲基转移到组氨酸上生成的。3-甲基组氨酸排出增多为肌肉损伤的标志,Ala丙氨酸,239.98-327.26mol/L常规氨基酸,可与其他氨基酸相互
8、转化,Asa 精氨(基)琥珀酸,精氨(基)琥珀酸尿症:缺精氨琥珀酸裂解酶，是常染色体隐性遗传性疾病。病人尿中精氨琥珀酸增加，血氨有时增加 临床表现为身体与智力发育迟缓，肝肿大、皮肤病变、头发脆而呈结节且在荧光照射下呈红色反应、癫痫和发作性昏迷（痉挛）。减少食物中蛋白质含量可减轻症状。,GABA-氨基丁酸,在正常情况下，脑内GABA由突触前神经元利用谷氨酸合成，并在中枢神经系统内分解。中枢神经系统以外的GABA系肠道细菌分解的产物，GABA被吸收入肝脏，将在肝内进行代谢。血液中的GABA通常是不能穿过血脑屏障的，因而也不参与神经系统的神经生理过程。肝功能衰竭时，GABA将会过多地通过肝脏或绕过肝
9、脏进入体循环，使血中GABA浓度增高，通过通透性增强的血脑屏障进入中枢神经系统，导致神经元突触后膜上的GABA受体增加并与之结合，使细胞外氯离子内流，神经元即呈超极化状态，造成中枢神经系统功能抑制,第三组份BAad-aminoadipic acid-氨基己二酸 Ans Anserine 鹅肌肽 Car carnosine 肌肽bAib-aminoisobutyric acid-氨基异丁酸 Pro 脯氨酸Arg 精氨酸Hyl-hydroxylysine-羟基赖氨酸 Abu-amino-n-butyric acid-氨基正丁酸 Orn 鸟氨酸Cth 胱硫醚 Cys 半胱氨酸Lys 赖氨酸,Aad-
10、氨基己二酸,-氨基己二酸血症:赖氨酸氧化缺陷所致的有机酸尿症的一种.-己二酸为羟基-L-赖氨酸和L-色氨酸氧化的中间产物，在两次酶促反应作用下转化成脂肪酸氧化的中间产物巴豆酰辅酶A，这两个酶即-酮己二酸脱氢酶和戊二酰辅酶A脱氢酶，其遗传性缺陷分别引起-酮己二酸血症和戊二酸血症型。,Ans 鹅肌肽,抗氧化剂,减少疲劳,Car 肌肽,又称-丙氨酸-L-组氨酸,由肌肽合成酶合成。肌肽在生物组织中广泛分布,尤其在细胞不分裂的组织中,如肌肉和大脑嗅叶含量甚高。在老年病中是研究的热点素食中不存在肌肽早期的研究认为肌肽是一种神经递质,可激活ATP 酶,具有抗氧化剂活性,可保护噬菌体免受电离辐射的致死作用。肌
11、肽是一个抗氧化剂,能捕捉氧自由基,具有延缓衰老作用,还具有逆转老年细胞衰老形态的强大效果。,bAib-氨基异丁酸,在生物体内的5-甲基嘧啶即为其前体。存在健康人的尿中（约150mg/L），在食入含DNA丰富的食物,经放射线治疗或化学治疗的患者,以及白血病患者,排出的氨基酸量约为其2倍。,Pro 脯氨酸,122.02243.06mol/L。高脯氨酸血症I型 致病原因是因为脯氨酸氧化酶(一种线粒体内膜酶)的缺陷,其作用在於可催化脯氨酸(proline).此类患者的(proline)含量增高现象(1000M)也可在高乳酸血症中观察到 羟基脯氨酸和脯氨酸是人体自身合成胶原蛋白的重要氨基酸,Arg 精氨
12、酸,54.7990.81mol/L 婴幼儿为必需氨基酸。精氨酸是鸟氨酸循环中的一个组成成分，精氨酸对高氨血症、肝脏机能障碍等疾病有指导作用如果缺乏精氨酸，机体便不能维持正氮平衡与正常的生理功能。病人若缺乏精氨酸会导致血氨过高，甚至昏迷。精氨酸的重要代谢功能是促进伤口的愈合作用，它可促进胶原组织的合成，故能修复伤口。精氨酸的免疫调节功能，可防止胸腺的退化（尤其是受伤后的退化），补充精氨酸能增加胸腺的重量，促进胸腺中淋巴细胞的生长。,Hyl-羟基赖氨酸,羟基赖氨酸尿症，有严重的智力障碍，尿中排出羟基赖氨酸，但代谢障碍部位不明。,Abu-氨基正丁酸,酒精中毒者的血浆、肌肉、肝脏支链氨基酸增加(bra
13、nched-chain amino acid)及血浆、肌肉中氨基正丁酸(-amino-n-butyric acid)增加,Orn 鸟氨酸,是由精氨酸为碱或精氨酸酶作用分解生成。作为尿素循环的一部分与尿素生成相关，在代谢上具有重要的作用。鸟氨酸参与尿素循环的活化和氨的解毒过程,降低血氨,可为抢救病人赢得宝贵的时间,Cth胱硫醚,半胱氨酸和丝氨酸的结合物。是含硫氨基酸的代谢中间体，参与半胱氨酸和蛋氨酸的相互转换。当分解它的酶（胱硫醚酶）缺乏时，会使血中胱硫醚浓度上升，一种先天性代谢异常,Cys 半胱氨酸,4.4011.52mol/L参见同型半胱氨酸,Lys 赖氨酸,188.68272.32mol/
14、L 8种必需氨基酸之一参与结缔组织、微血管上皮细胞间质的形成，并保持正常的渗 透性。持续性高赖氨酸血症，主要症状为惊厥、智力障碍、发育障碍、肌张力低下和韧带松弛等。本病大概是常染色体隐性遗传。周期性高赖氨酸血症和高氨血症，主要症状为出生后不久以呕吐、惊厥或昏睡而发病，尿中赖氨酸的排出可见增多，但未发现有其他赖氨酸代谢产物。如果缺乏，会降低人的敏感性，妇女会停经，出现贫血、头晕、头昏和恶心等病状。,第四组份Val 缬氨酸 Met 蛋氨酸Tyr 酪氨酸Nva正缬氨酸Hcy 同型半胱氨酸Ile 异亮氨酸Leu 亮氨酸Nle 正异亮氨酸Phe 苯丙氨酸Trp 色氨酸,Val 缬氨酸,207.78242
15、.34mol/L 8种必需氨基酸之一促使神经系统功能正常。如果缺乏时，会造成触觉敏感度特别提高，肌肉的共济运动失调,可作为肝昏迷的治疗药物高缬氨酸血症，血、尿中缬氨酸有特异的增加，患者的白细胞出现缬氨酸氨基转移作用的特异性障碍，发育障碍、智力障碍、为常染色体隐性遗传。枫糖尿症，血及尿中亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸及酮酸显著增加,Met 甲硫氨酸（蛋氨酸）,15.3434.49mol/L 8种必需氨基酸之一参与胆碱的合成，具有去脂的功能，防治动脉硬化高血脂症。有提高肌肉活力的功能。促进皮肤蛋白质和胰岛素的合成。,Tyr 酪氨酸,48.9485.22mol/L高酪氨酸血症，血液中酪氨酸含量显著增加，智
16、力明显障碍并伴有一些先天性畸形，可见手掌、足底有角化症和角膜萎缩。调节饮食中所含的酪氨酸，角化症及角膜萎缩得到改善。肝脏可溶性部分的酪氨酸转氨酶减低，但在线粒体部分为正常值，本病为常染色体隐性遗传,Nva正缬氨酸,正缬氨酸在生理意义上抑制精氨酸酶,从而提高精氨酸在血中的含量.,Hcy 同型半胱氨酸,同型胱氨酸尿症,本症的原发性损害为胱硫醚合成酶的遗传缺陷。其结果造成血中蛋氨酸、尿中同胱氨酸的增加。同型胱氨酸除被合成为胱硫醚之外，经再次甲基化，可重新恢复为蛋氨酸，由于这种再循环过程的障碍而导致的同型胱氨酸尿症之中，有一种为N15-亚甲基四氢叶酸甲基转氨酶的障碍所致。由于N5，10-亚甲基四氢叶酸
17、还原酶缺乏也可导致同型胱氨酸血症.冠心病后降脂的指标,Ile 异亮氨酸,41.9787.41mol/L 8种必需氨基酸之一能维持机体平衡，治疗精神障碍。有促进食欲的增加和抗贫血的作用。如果缺乏时，会出现体力衰竭，昏迷等症状。枫糖尿症，血及尿中亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸及酮酸显著增加,Leu 亮氨酸,100.41133.75mol/L 8种必需氨基酸之一降低血液中的血糖值，对治疗头晕有作用促进皮肤、伤口及骨头有愈合作用。如果缺乏时，会停止生长，体重减轻。枫糖尿症，血及尿中亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸及酮酸显著增加,Nle正异亮氨酸,日增重与日异亮氨酸摄入量之间正相关,相关系数为0.9529,Phe苯丙
18、氨酸,37.0984.03mol/L 8种必需氨基酸之一在机体内转变为酪氨酸促进甲状腺素和肾和肾上腺素的合成 苯丙酮尿症患者的肝脏组织中缺乏把苯丙氨酸氧化成酪氨酸所需的触酶，即苯丙氨酸羟化酶 高苯丙氨酸血症：大多数将空腹血清苯丙氨酸含量在200g/L以上者称为典型苯丙酮尿症，其含量在200g/L以下者称为高苯丙氨酸血症。出现高苯丙氨酸血症的原因是由于肝脏的苯丙氨酸羟化酶呈不完全缺陷，尚残留有部分活性，所以肝脏在某种程度上还能处理苯丙氨酸。,Typ 色氨酸,28.5272.28mol/L 8种必需氨基酸之一色氨酸代谢过程发生障碍所致的疾病有色氨酸尿症，羟基犬尿氨酸尿症和黄尿酸尿症。这些疾病是由于
19、从色氨酸到烟酸及辅酶I的主要代谢途径发生障碍促进血红蛋白的合成。防治癞皮病。促进生长，增加食欲。,Allo Isoleucine 别异亮氨酸,需要另外鉴定枫糖尿症的特异生物标志物.,45种氨基酸的临床应用,肾脏疾病患者体液氨基酸模式游离氨基酸在血浆中显著增高,慢性肾炎和尿毒症的Val/Gly、Try/Phe的比例降低.慢性肾炎的尿液中游离氨基酸升高.肝性脑病的发病机制中体液氨基酸模式氨中毒学说假性神经递质学说血浆氨基酸失衡学说-氨基丁酸学说,肾性氨基酸尿(Renal Amino Acid Uria),氨基酸尿可分为生理性和病理性两类。病理性又可分为肾前性和肾性。肾前性又分为溢出性(如苯酮尿症、
20、槭树汁尿症等)和竞争性(如高脯氨酸血症、高-丙氨酸血症等)。此类氨基酸尿不属肾小管疾病之列。肾小管对氨基酸转运的差异不同，此组疾病又分为：全氨基酸尿尿中出现多种氨基酸，同时伴有其他近端肾小管功能障碍，如葡萄糖尿、磷酸盐尿、氢离子分泌减少、尿钾增高等。典型例子，如Fanconi综合征、lowe综合征等。某种或某组氨基酸尿 近端肾小管对某种或某一组氨基酸的转运系统缺陷，尿中有大量该种或某一组氨基酸，同时多数患者几乎都伴空肠对该组氨基酸的转运缺陷。二碱基氨基酸(胱氨酸、赖氮酸，精氨酸和鸟氨酸)转运系统缺陷，如典型的胱氨酸尿、二碱基氨基酸尿、高胱氨酸尿等。中性氨基酸转运系统缺陷，如Hartnup病。亚
21、氨基甘氨酸(脯氨酸、羟脯氨酸及甘氨酸)转运系统缺陷，如亚氨基甘氨酸尿。二羧基氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)转运系统缺陷，如二羧基氨基酸尿症。,氨基酸监测对肝性脑病的指导,肝性脑病是肝功能不全发展至晚期失代偿阶段的最终临床表现，死亡率高。鉴于肝性脑病的发病机制较为复杂，而且其发病是多因素综合作用的结果，因此防治措施也应是综合性的，其中去除诱因和防治并发症尤为重要。消除诱因（Obliteration of predisposing causes）掌握肝功能衰竭时机体物质代谢的表现形式，了解其机制降低血氨（Reduction of blood ammonia）多年来临床上常用谷氨酸、精氨酸等药物来降低血
22、氨。谷氨酸的作用在于可结合氨生成谷氨酸胺；精氨酸的作用则在于维持鸟氨酸循环，促进尿素合成增强正常神经递质的功能（Improvement of normal neurotransmitter）补充正常神经递质，使其与脑内假性神经递质竞争，从而恢复正常的神经系统功能。可应用含有高支链氨基酸、低芳香族氨基酸再加精氨酸的混合氨基酸制剂，通过恢复血氨基酸平衡来治疗肝性脑病,静脉营养中的氨基酸,用以防治体内蛋白质的消耗、维持正氮平衡、促进组织愈合。严重创伤、败血症等病人特别需要支链氨基酸，如亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸，其在改善氮平衡上有特别的作用；肾功能衰竭病人提供的制剂中，以8种必需氨基酸为主；一般的静脉
23、营养治疗，应选用含非必需氨基酸较多的注射液效果较好。不同病种，同一病种个体之间，对氨基酸的需求不同，则应提供不同的氨基酸制剂。氨基酸可与糖类同时输人，这样可使氨基酸更为有效地合成蛋白质,氨基酸在肾病的临床应用,必需氨基酸注射液,肾用氨基酸输液。主要适用于慢性肾衰，尤其是呈负氮平衡而低蛋白饮食不能纠正者，也可用于急性肾衰患者及透析患者营养状态的改善。,本文观看结束！,谢 谢欣 赏！,5-Aza-CdR对人食管癌细胞株生物学行为及TFPI-2 mRNA表达的影响,5-Aza-CdR对人食管癌细胞株生物学行为及TFPI-2 mRNA表达的影响 作者：杜雅冰，邵应举，樊青霞，孙桢，王琳，赵培荣 作者单
24、位：(郑州大学第一附属医院肿瘤内科，河南郑州450002)【摘要】目的探讨5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-2-deoxycytidine,5-Aza-CdR)干预对食管鳞癌细胞株Eca9706生长增殖及其组织因子途径抑制物2(tissue factor pathway inhibitor-2，TFPI-2)基因表达的影响。方法选取食管鳞癌细胞株Eca9706，并用不同浓度的5-Aza-CdR处理该细胞株。MTT法检测干预前后细胞增长率的变化，FCM法检测干预前后细胞凋亡率的变化，RT-PCR技术检测干预前后Eca9706细胞TFPI-2基因mRNA的表达，免疫组化检测干预前后Eca9706
25、细胞TFPI-2蛋白的表达。结果食管鳞癌细胞株Eca9706存在TFPI-2基因超甲基化状态，经5-Aza-CdR处理后，超甲基化状态解除，细胞增殖受到抑制，细胞凋亡率明显提高(P0.05);细胞中TFPI-2蛋白表达明显增强，同时mRNA的表达水平也较处理前明显提高(P0.05)。结论食管癌细胞系TFPI-2基因超甲基化可抑制其mRNA表达，当其超甲基化解除后，细胞增殖受到抑制，同时细胞凋亡率相应提高。,【关键词】食管癌;组织因子途径抑制物-2;5-氮杂-2-脱氧胞苷;甲基化;免疫组化;逆转录聚合酶链反应;凋亡 ABSTRACT：ObjectiveTo explore the effects
26、 of 5-Aza-2-deoxycytidine(5-Aza-CdR)intervention on the growth and proliferation of Eca9706 cell line and protein expression of tissue factor pathway inhibitor-2(TFPI-2).MethodsEca9706 cell line was treated by 5-azaCdR of different concentrations;MTT，flow cytometry，immunohistochemistry and RT-PCR we
27、re used to determine the cell growth，apoptosis，and the expression of TFPI-2 gene and its protein.ResultsEca9706 cell line had hypermethylation of TFPI-2.After demethylation by 5-Aza-CdR treatment，the proliferation of Eca9706 was inhibited，the apoptosis rate was also increased significantly in the co
28、ncentration-dependent manner.RT-PCR detected that mRNA expression of TFPI-2 gene in Eca9706 cell line recovered significantly(P0.05).Conclusion5-Aza-CdR can slow the growth of Eca9706 cell，increase the apoptosis rate，reactivate the TFPI-2 gene transcription and protein expression by demethylation.KE
29、Y WORDS：esophageal carcinoma;tissue factor pathway inhibitor-2;5-Aza-CdR;methylation;immunohistochemistry;RT-PCR;apoptosis,组织因子途径移植物2(tissue factor pathway inhibitor，TFPI-2)是丝氨酸蛋白酶抑制物，在调控肿瘤细胞浸润转移方面起着重要作用。目前，关于TFPI-2在食管癌中的基因表达情况的分析研究尚少。本研究旨在探讨TFPI-2基因的失活机制，并寻找食管癌治疗的新靶点。1材料与方法 1.1材料 RPMI-1640培养基购自北京索莱
30、宝生物科技有限公司;标准胎牛血清购自天津市灏洋生物制品科技有限公司;Trizol试剂购自MBI公司;RT-PCR试剂盒购自MBI公司;5-Aza-CdR购自Sigma公司;人食管癌细胞株Eca9706由郑州大学肿瘤生物学研究室惠赠。1.2细胞培养和药物处理 人食管癌细胞Eca9706以含10 mL/L胎牛血清的RPMI-1640培养基，37、50 mL/L CO2培养箱培养，每23 d消化传代1次。1.3MTT法检测干预前后细胞增长率的变化 取对数生长期细胞，调整密度至5104/mL接种于96孔板，按5-Aza-CdR浓度分为6组：0、0.4、1.6、6.4、25.6、102.4 mol/L，
31、每组复设5个孔。待细胞贴壁后，分别于24、48、72 h后加入MTT液，4 h后弃去上清液，每孔加DMSO 150 L，在490 nm波长测定各孔吸光度值(absorbance，A)。细胞增殖抑制率(cellular proliferation inhibition rate，CPIR)按公式计算：CPIR=(1-实验组A均值/对照组A均值)100%。,1.4流式细胞仪(FCM)检测干预前后细胞凋亡率的变化 取对数生长期细胞，按5105/mL的密度接种于6孔板内，待细胞贴壁后加药，分组如下：对照组(0 mol/L),1.6 mol/L 5-Aza-CdR组，25.6 mol/L 5-Aza-C
32、dR组，102.4 mol/L 5-Aza-CdR组。每组均于5-Aza-CdR作用48 h后消化收集细胞，700 mL/L冰乙醇固定，流式细胞仪进行细胞凋亡测定。1.5RT-PCR技术检测TFPI-2基因mRNA的表达 分组同FCM，每组细胞均5-Aza-CdR作用48 h。TFPI-2的上、下游引物分别为5-GTCGATTCTGCTGTTTTCC-3和5-ATGGAATTTTC TTTGGTGCG-3，合成产物为440 bp;-actin作为内参照，上下游引物分别为5-AGGCATTGTGATGGACTCCG-3和5-AGTGATGACCTGGCCGTCAG-3，合成产物为301 bp。按
33、照试剂盒说明书，用Trizol试剂提取细胞总RNA，经紫外分光光度计分析后，按Sigma公司RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit说明书操作。先逆转录制备单链cDNA，再以逆转录产物为模板，用上、下游产物进行PCR反应扩增目的基因。反应条件为：94 预变性3 min，然后94 变性30 s,51 退火30 s,72 延伸30 s，循环30次，最后72 延伸5 min,4 保温。扩增片段经20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。,1.6免疫组化方法检测TFPI-2蛋白的表达 取对数生长期细胞，按5104/mL的密度接种于经预处理的盖玻片上，待细胞贴壁后加药(分
34、组同RT-PCR)。培养48 h后加入40 g/L多聚甲醛溶液固定30 min,30 mL/L H2O2封闭内源性过氧化物酶，室温下10 min,100 mL/L动物血清封闭，室温下10 min，滴加1100的稀释的TFPI-2抗体4 过夜，二抗室温下1 h，滴加辣根酶标记链霉卵白素，37 孵育30 min，DAB显色，苏木精复染，脱水透明封片。另取爬片滴加PBS 液代替一抗作为阴性对照。结果判定：TFPI-2蛋白阳性信号均呈棕黄色颗粒样物质，位于细胞质内。光镜下随机选取10个视野(每个视野观察细胞数不少于100个)，按阳性细胞所占百分比进行结果判定。阳性率=(阳性细胞数/1 000)100%
35、。1.7统计学处理 应用SPSS16.0软件进行统计学处理。实验数据采用均数标准差(x-s)表示，采用单因素方差分析加LSD两两比较法进行分析。检验水准=0.05。2结果 2.1干预前后细胞增长率的变化 经MTT检测，结果显示，实验组细胞抑制率明显高于未加药组，且随着作用时间的延长和浓度的增加而增加(表1)。表1不同浓度的5-aza-CdR对Eca9706细胞增殖的影响,2.2干预前后细胞凋亡率的变化 流式细胞仪分析可见，经不同浓度5-Aza-CdR诱导48 h后，Eca9706细胞各处理组凋亡率分别为(13.760.47)%、(26.970.39)%、(41.030.19)%，与5-Aza-
36、CdR诱导浓度成正比。与对照组(1.390.27)%比较差异有统计学意义(P0.05)，且各浓度组间比较差异亦有统计学意义(P0.05，图1)。以上实验重复5次。2.3干预前后Eca9706细胞mRNA的表达情况 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示，Eca9706细胞中TFPI-2 mRNA表达在各用药组和未用药组之间有明显差异，TFPI-2 mRNA在未用药组细胞中未见表达。经1.6、25.6、102.4 mol/L 5-Aza-CdR处理后可见TFPI-2 mRNA表达，表明在一定范围内随5-Aza-CdR药物浓度的增加TFPI-2 mRNA表达逐渐增强(图2)。图1各组流式细胞凋亡散点图A：对
37、照组;B：1.6 mol/L 5-Aza-CdR组;C：25.6 mol/L 5-Aza-CdR组;D：102.4 mol/L 5-Aza-CdR组。图25-Aza-CdR处理前后Eca9706细胞TFPI-2 mRNA的表达M：DNA marker;-actin：301 bp;TFPI-2：440 bp;1：对照组;2：102.4mol/L组;3：25.6 mol/L组;4：1.6 mol/L组;5：H2O对照组。,2.4干预前后TFPI-2蛋白的表达情况免疫组化结果显示，经5-Aza-CdR作用Eca9706细胞48 h，,TFPI-2蛋白的阳性表达率增加，对照组、1.6 mol/L组、2
38、5.6 mol/L组、102.4 mol/L组TFPI-2蛋白的阳性表达率分别为(2.101.42)%、(9.312.70)%、(14.723.50)%、(68.203.20)%，不同浓度组之间以及用药组与对照组之间的差异均有统计学意义(P0.05，图3)。图3各组TFPI-2蛋白的表达情况 3讨论 人TFPI-2(hTFPI-2)基因定位于7q22区域，全长由8164个碱基组成，其cDNA全长为1 222 kb。其mRNA的启动子具有典型的管家基因特征，没有典型的TATA盒或CAAT盒，在推定的转录起始位点区域GC含量超过80%1。TFPI-2可在体内多种组织广泛表达，在这些组织内一旦出现肿
39、瘤，TFPI-2的表达水平也会随之显著下降2。有研究证实，在绒毛膜癌、乳腺癌、前列腺癌、神经胶质细胞瘤、纤维肉瘤和胸部恶性肿瘤组织中，与肿瘤产生相关的TFPI-2表达水平减少可能与其启动子的甲基化密切相关1,3-5。启动子区cpG岛高甲基化在肿瘤形成机制中的确切作用尚不清楚，然而众多证据表明，肿瘤抑癌基因CpG岛异常的甲基化导致基因失活和转录抑制是肿瘤发生的重要机制之一6-8。,目前，有体外实验表明，DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR通过去甲基化作用可使多种含有CpG岛的高甲基化抑癌基因重新表达，从而恢复抑癌功能9。本实验RT-PCR结果显示，TFPI-2在Eca9706细胞中无表达，经
40、过不同浓度的5-Aza-CdR处理Eca9706细胞后，TFPI-2亦重新出现表达，且在一定范围内随药物诱导浓度的增大表达逐渐增强。MIZUNO等10研究表明，肿瘤细胞中DNMT的表达较正常的高412倍，也证实DNMT上调参与肿瘤发生。这与我们的实验结果一致。根据MTT实验可知，经过5-Aza-CdR干预处理过的Eca9706细胞增殖明显受抑制，且随着药物浓度的增加，抑制作用越明显。从本实验结果分析，DNA启动子区去甲基化能较明显地抑制食管癌细胞增殖，并与其诱导剂量呈正相关，推测这种抑制作用与去甲基化后重新激活TFPI-2基因的转录和表达有着直接关系;此外可能与去甲基化后诱导细胞凋亡有关。进而
41、通过流式细胞仪分析，结果显示，经不同浓度5-Aza-CdR干预的Eca9706的细胞中，用药组与对照组相比细胞凋亡率凋亡率有所增加，并且与5-Aza-CdR诱导剂量有依赖性关系。BENDER等11在同等条件下用5-Aza-CdR处理恶性肿瘤细胞系和正常纤维细胞系时，发现肿瘤细胞增殖均被抑制，而纤维细胞增殖不被抑制。因此，5-Aza-CdR对Eca9706细胞增殖的抑制及凋亡的增加不是药物的毒性影响，可能是因为使TFPI-2重新表达的结果。,目前，国外以TFPI-2为药物研究靶点，就TFPI-2在肿瘤治疗、肿瘤临床诊断、促进伤口愈合和动脉粥样硬化治疗等领域中的应用，也正在进行广泛深入的研究。本研
42、究用甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR处理人食管癌Eca9706细胞株，检测TFPI-2基因表达的变化及其对细胞增殖和凋亡的影响，以期寻找治疗肿瘤的新靶点。【参考文献】1HUBE F，REBERDIAU P，IOCHMANN S，et al.Characterization and functional analysis of TFPI-2 gene promoter in a human choriocarcinoma cell line J.Thromb Res，203，109(4)：207-215.2MIYAGIi Y，KOSHIKAWA N，YASUMITSU H，et al.cDNA
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46、cancer J.Nat Rev Genet，2002，3(6)：415-428.8EHRLICH M.DNA methylation in cancer：too much，but also too little J.Oncogene，2002，21(35)：5400-5413.9PAZ MF，FRAGA MF，AVILA S，et al.A systematic profile of DNA methylation in human cancer cell lines J.Cancer Res，2003，63(5)：1114-1121.,10MIZUNO S，CHIJIWA T，OKAMUR
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