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1、1,2005版中国药典微生物限度检查修订内容,辽宁省药品检验所赫爱平、张雅杰,2,一、2005年版药典微生物限度标准修订情况二、2005年版药典微生物限度检查法的修订情况三、药品微生物限度检查法的验证,3,一、2005年版药典微生物限度标准修订情况,4,（一）、2005年版微生物限度标准的制订原则,2000年版：细菌数、酵母菌数和霉菌数按剂型制订；控制菌（致病菌）按给药途径制订。2005年版：均按给药途径制订。理由：同一剂型有不同的给药途径；新剂型的出现；国外药典的限度标准制订原则,5,（二）、2005年版微生物限度标准的应用,本版药典明确指出:药品的生产、贮存、销售过程中的检验,原料及辅料(
2、中药提取物及辅料)的检验,新药标准制订,进口药品标准复核,考察药品质量及仲裁等,除另有规定外，其微生物限度均以本标准为依据。,6,（三）、2005年版微生物限度标准的控制项目,杂菌数：细菌数 霉菌和酵母菌数控制菌（致病菌）:大肠埃希菌 大肠菌群（含药材原粉及豆豉、神曲等发酵成分制剂）沙门菌 铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌 梭菌（阴道、尿道给药制剂）,7,（四）2005年版微生物限度标准的分类,1.制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂，应符合无菌检查法规定。,8,2.口服给药制剂,不含药材原粉的制剂含药材原粉的制剂含豆豉、神曲等发酵成分的制剂,9,3.局部给药制剂,用于手术、烧伤及严重
3、损伤的局部给药制剂（无菌）用于表皮或黏膜不完整的含药材原粉的局部给药制剂 用于表皮或黏膜完整的含药材原粉的局部给药制剂 眼部给药制剂（由100，不得检出10，不得检出）耳、鼻及呼吸道吸入给药制剂 阴道、尿道给药制剂（含生药原粉的深部用药，破伤风杆菌梭菌）直肠给药制剂 其它局部给药制剂,10,4、兼用给药途径的制剂，应符合各给药途径的标准,11,（五）、2005版制剂通则项下的 微生物限度要求,12,1、2005版化学药制剂通则项下的微生物限度要求,无菌检查：注射剂、植入剂、冲洗剂。无菌检查及微生物限度检查：软膏剂、眼用制剂、气雾 剂、喷雾剂、散剂、耳用制剂、鼻用制剂、凝胶剂、乳膏剂。微生物限度
4、检查：粉雾剂、口服溶液剂、口服混悬剂、口服乳剂、搽剂、洗剂、局部用片剂、酊剂、栓剂、糖浆剂、膜剂、贴剂、灌肠剂、糊剂、涂剂、涂膜剂。原则性要求：丸剂、口服片剂、胶囊剂、颗粒剂。,13,2、2005版中药制剂通则项下的微生物限度要求,无菌检查：注射剂。无菌检查及微生物限度检查：散剂、软膏剂、眼用制剂、鼻用制剂、气雾剂、喷雾剂。微生物限度检查：丸剂、颗粒剂、片剂、锭剂、煎膏剂、胶剂、糖浆剂、合剂、滴丸剂、胶囊剂、酒剂、酊剂、流浸膏剂、浸膏剂、露剂、茶剂、栓剂、贴膏剂(贴剂)、凝胶剂、搽剂、洗剂、涂膜剂.不要求：膏药。,14,3、2005版三部制剂通则项下的微生物限度要求,无菌检查：注射剂、外用溶液
5、剂、灌洗剂。微生物限度检查：片剂、栓剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、气雾剂。无菌检查或微生物限度检查：软膏剂、乳膏剂、凝胶剂、喷雾剂、眼用制剂、鼻用制剂。,15,（六）、品种项下的微生物限度要求,辅料：乳糖、淀粉、糊精、玉米朊、精制玉米油等。纯化水：微生物限度 取本品，采用薄膜过滤法处理后，依法检查（附录 J），细菌、霉菌和酵母菌总数每1ml不得过100个。注射用水：微生物限度 取本品至少200ml，采用薄膜过滤法处理后，依法检查（附录 J），细菌、霉菌和酵母菌总数每100ml不得过10个。,16,二、2005年版药典微生物限度检查法的修订情况,二00四年十月,17,起草的指导思想:完善检查法.增加
6、试验的可操作性.使方法更具科学性，保证检验结果的准确性.与国际接轨.,（一）微生物限度检查法,18,（二）增、修订内容（1）总则,操作环境洁净度：微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。洁净度定期检测:单向流空气区域、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌、和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度验证。,19,细菌培养温度:3035。霉菌、酵母菌培养温度:23（25）28。控制菌培养温度:3537结果报告：以1g、1ml、10g、10ml 或 10cm2 为单位报告。,20,（2）检
7、验量,抽样量：随机抽取不少于检验量（两个以上最小包装单位）的3倍。检验量：一次试验所用的供试品的量。一般为10g或10ml；中药膜剂50 cm2，化学药膜剂为100cm2；贵重或微量包装的药品酌减（不得少于3g）。检查沙门菌的供试品其检验量改为10g或10ml。从2个包装以上取样。,21,（3）供试液制备,表面活性剂、中和剂或灭活剂：应证明其有效性及对微生物的生长和存活无影响。供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45。供试液的体积：100ml。,22,供试品分类液体供试品 固体、半固体或黏稠液性供试品需用特殊供试液制备方法的供试品 非水溶性供
8、试品 膜剂供试品 肠溶及结肠溶制剂供试品 气雾剂、喷雾剂供试品 具抑菌活性的供试品,23,非水溶性供试品：增加“十四烷酸异丙酯法”（如油溶膏剂等）。结肠溶制剂供试品：用pH7.6无菌磷酸盐 缓冲液溶解。气雾剂、喷雾剂供试品：冷冻1小时，放尽抛射剂，药液加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨B.S。具抑菌活性的供试品：增加方法的可操作 性（细化）。,24,（4）灭菌,培养基及稀释剂等灭菌:采用验证合格的灭菌程序进行灭菌。,25,（5）稀释剂,稀释剂：pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲溶液（增 加检出率，对被破坏的微生物有复 苏作用）pH6.8无菌磷酸盐缓冲液 pH7.6无菌磷酸盐缓冲液,26,（6）细菌、霉菌
9、、酵母菌计数平皿法,培养时间:必要时，可适当延长培养时间至57天.点计：逐日点计.同稀释级两个平板的菌落平均数不小于15时，则两个平板菌落数不能相差1倍或以上。培养基平板上生长特殊菌落：以菌落数高的培养基中的菌数为记数结果。菌数报告规则：（1）、（2）、（3）、（4）。,27,薄膜过滤法,方法：滤膜、材质、过滤等相关要求。操作注意：避免微生物受损，降低检出。取相当于1g或1ml供试品的供试液lml直接过滤，或加至100ml稀释剂中，混匀，过滤。用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其它适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法和冲洗量同“方法的验证”。冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼
10、脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。,28,菌数报告规则：以相当于1g或1ml供试品的菌落数报告；若滤膜上无菌落生长，以1报告菌数（每张滤膜过滤1g或1ml供试品），或乘以稀释倍数的值报告菌数。,29,（7）控制菌检查,修订特点:减少篇幅 不作具体生化试验的规定 增加鉴定方法 适应微生物分类变化要求 增加控制菌检查项,30,修订的检查法 大肠埃希菌检查法、铜绿假单胞菌检查法、沙门菌检查法、金黄色葡萄球菌检查法。新增的检查法大肠菌群检查法（近期、远期污染）、梭菌检查法检查法。,31,供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行，增菌培养基的实际用量同控制菌检查
11、方法的验证。,32,三、药品微生物限度检查法的验证,33,（一）概述 验证的目的:确认所采用的方法适合于供试品的微生物限度检查。验证的意义：保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。,34,验证的必要性 理论上要求、试验结果要求 验证的内容 准确性(回收率)、专属性,35,验证的类型前验证:建立药品的微生物限度检查法时.再验证:修订的检验方法;供试品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时;定期的方法验证.,36,验证用菌株：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠 菌、黑曲霉、枯草杆菌。菌株选择的原则:代表性,普遍性,低或非致病性,标准 菌株(或该药品中常见的污染菌)。菌种的要求：不得超过
12、5代。采用适宜的方法保存。菌液制备:50100cfu/ml。,（二）细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证,37,菌液的制备,1取经37培养18-24小时，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌、铜绿假单胞菌 10104肉汤培养物、生孢梭菌 64941硫乙醇酸盐培养物1ml+9ml盐水10倍稀释至10-5 10-7为50100个/ml，做活菌计数备用2取经25 培养1824小时的白色念珠菌霉菌液体培养物1ml+9 ml盐水10倍稀释至10-5 10-6为50100个/ml，做活菌计数备用3取经25 培养1周的黑曲霉菌斜面培养物，加35ml盐水洗下霉菌孢子，吸取出菌液，用标准比浊管比浊，与浊度相当后，取1
13、 ml+9 ml盐水=10-1，逐管10倍稀释为10-4约50100个/ml，做活菌计数备用,38,验证方法：至少进行3次独立的平行试验 试验组 菌液组 供试品对照组 稀释剂对照组,39,结果判断：供试品组的菌回收率、稀释剂对照组的菌回收率。试验组的菌回收率=（试验组平均菌落数供试品对照组平均菌落数）/菌液组平均菌落数 100%稀释剂对照组的菌回收率=（稀释剂对照组的平均菌落数/菌液组的平均菌落数）100%判断标准:菌回收率均不低70%。,40,（三）控制菌检查法的验证,试验菌株：按规定检查的控制菌选择相应验证的菌株。阴性对照菌株:设立阴性对照菌是为了验证该控制菌检查方法的专属性。金黄色葡萄球
14、菌、铜绿假单胞菌、梭菌用大肠埃希菌；大肠埃希菌、沙门菌、大肠菌群用金黄色葡萄球菌。菌种的要求：不得超过5代。采用适宜的方法保存。菌液制备:10100cfu/ml。,41,验证方法：试验组 阴性菌对照组结果判断：试验组应检出 阴性菌对照组不得检出,42,（四）药品微生物限度检查法验证试验结果不符合要求的处理方法,中和法培养基稀释法薄膜过滤法离心沉淀法联合方法,43,四、药品微生物限度检查法验证示例,44,银翘解毒片-金黄色葡萄球菌(常规法),-,45,银翘解毒片-大肠埃希菌(常规法),-,46,银翘解毒片-白色念珠菌(常规法),-,47,银翘解毒片-黑曲霉(常规法),-,48,银翘解毒片-枯草杆菌(常规法),-,49,银翘解毒片-枯草杆菌(稀释法-5个平皿),-,50,银翘解毒片-枯草杆菌(稀释法-10个平皿),-,51,银翘解毒片-枯草杆菌(低速离心+稀释法),-,52,银翘解毒片-枯草杆菌(低速离心+薄膜过滤法),-,53,结论银翘解毒片的细菌、霉菌及酵母菌的计数方法：低速离心+稀释法 低速离心+薄膜过滤法,谢谢！,
