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1、1,临床微生物标本采集与实验室分析陶传敏四川大学华西医院实验医学科临床微生物室,2,主要内容临床常见感染相关的病原菌、定植菌微生物标本送检率及采集与运送要点 正确解读临床微生物室报告,3,与临床各科密切相关是医院感染重要组成部分医院感染耐药细菌引起者多见治疗棘手,病死率高临床微生物实验室参与诊治,细菌感染,4,经验治疗 循证治疗empirical therapy evidence-based therapy,感染发生基础 感染病情程度 疑为细菌感染 肯定细菌感染 可能病原菌 阳性病原菌目前耐药情况 菌株耐药情况,5,临床常见感染相关的病原菌不同部位的常见定植菌,6,非细胞型 原核单细胞型 真核
2、多细胞型 病毒 细菌、支原体、衣原体 真菌 螺旋体、立克次体、放线菌,微生物,7,无细胞壁：立克次体、衣原体 支原体 有细胞壁：细菌、螺旋体、放线菌,细菌感染病原菌,G+菌：葡萄球菌属 链球菌属 肠球菌属,常见细菌,G+球菌：葡萄球菌属 金黄色葡萄球菌 S.aureus 凝固酶阴性葡萄球菌 CoNS 链球菌属-肺炎链球菌 S.pneumoniae 化脓性链球菌 S.pyogenic 肠球菌属-粪肠球菌 E.faecalis 屎肠球菌 E.faecium,临床常见细菌,10,G+杆菌：棒状杆菌属-J-K棒状杆菌 C.Jeikeium 李斯特菌属-产单核李斯特菌 L.monocytogenes 芽
3、孢杆菌属 炭疽芽孢杆菌 B、antrax 阴道加特纳菌-,临床常见细菌,G-球菌：奈瑟菌属 淋病奈瑟菌 脑膜炎奈瑟菌 莫拉菌属-卡他莫拉菌,临床常见细菌,12,G-杆菌：肠杆菌 科（22属）埃希菌属 大肠埃希菌 E.coli 沙门菌属 伤寒沙门菌 S.typhi 克雷伯菌属肺炎克雷伯菌 肠杆菌属 阴沟肠杆菌 产气肠杆菌,临床常见细菌,13,G-杆菌：非肠杆菌科 不动杆菌属 假单胞菌属 产碱杆菌属 军团杆菌属,临床常见细菌,14,15,下呼吸道感染常见 病原菌 定植菌,16,下呼吸道标本分离的前三位细菌,17,尿路感染的常见 病原菌 定植菌,18,尿液标本分离的前三位细菌,19,血液感染的常见病
4、原菌：需氧菌：CONS、金葡、肺链、肠 球菌、肠杆菌科、绿脓杆菌、流感嗜血杆菌等厌氧菌：脆弱拟杆菌真菌：念珠菌等,20,血液标本分离的前三位细菌,21,伤口分泌物标本分离的前三位细菌,22,微生物标本采集与运送要点,一般原则抗生素使用前采集采集后及时送检避免正常菌群的污染适当的标本类型：反应感染部位、厌氧标本标本量足够专用培养杯,23,感染病原学诊断,临床微生物室 提高细菌培养药敏检测质量临床医生 送合格标本 准确解读报告单,24,抗菌药物滥用和乱用原因?,病原学诊断不明确 重视不够 标本质量低 就诊前或留取标本前使用抗生素率高病原学检测质量不高检出率低准确性差报告方式迟后报告信息不全药敏试验
5、欠规范,25,病原标本送检率(开始用药前),内科系统:68.1%,26,病原标本送检率(用药期间),内科系统:87.7%,27,几种重要微生物标本的采集时期及采集要点,28,血培养,29,美国 CUMITECH规定,病人：发热 380C体温下降：360CWBC：10.0X109个/LWBC：1.0 X109个/L以上4条任意一条符合，送血培养,【血行感染及其分期】（Blood stream Infection，BSI）,菌血症期 血培养阳性 bacteremia败血症期 全身感染中毒症状和体征 septicemia败血症综合征期-全身感染中毒症、征+脏器损害 sepsis败血症休克期-休克+上
6、述表现 septic shock,31,%死亡率,32,血培养的目的及意义,1，败血症唯一的确诊手段2，协助感染性疾病的诊断 病原菌 感染部位（全身、局部）3，判断预后4，指导治疗 合理选择抗生素 控制耐药菌的传播,不同抗感染治疗方案的疗效分析,A=正确抗感染治疗方案 I=不正确抗感染治疗方案Clin Infec Dis 24:584-602,1997,34,血培养系统,传统血培养血培养系统每天肉眼观察自动监测，10分钟一次普通孵育振荡孵育盲目传种自动绘制生长曲线，阳性自动报警只能做血培养血、无菌体液需氧培养需氧厌氧L菌结核菌,35,检测原理,细菌生长繁殖时产生CO2，通过各种手段检测CO2来
7、判断阴阳性放射性标记检测特殊感受器pH或氧化还原电势均质荧光技术,36,生长曲线,37,1998-2001年血培养的评价,7124份标本，阳性率11.5%，污染率0.3%阳性检出时间24hr内检出占69.9%48hr内检出占87.3%72hr内检出占91.3%,陶传敏等.华西医学.2002;17(3):366,38,三级报告制度,一级：阳性报警的当天直接涂片报告二级：第二天的直接药敏试验报告改为48hr的阴性报告（2005年）三级：第三天的正式报告,39,1998-2005年血培养送检情况,40,采血量与检出率的关系,41,影响阳性标本检出的因素,采血量阳性检出率的关键每增加1ml血量=增加3
8、%-5%灵敏度成人:8-10ml/培养瓶儿童:0.5-3ml/培养瓶尽量避免采血量不足,采血时间选择,第一组：发热峰值前2.5 12小时第二组：发热峰值前30分钟 2.5小时第三组：发热峰值后30分钟 1小时第四组：发热峰值后1 12小时,43,标本的采集时机,理论:寒战高热前1小时一般原则:发热初期或高峰时抗生素应用前已用药而不能中止者，在下次用药前,44,采血次数与阳性率的关系,45,采血次数：成人一般为23次提高菌血症的检出率弥补采血量的不足帮助判断是感染菌还是污染菌,46,解决的方法正确的皮肤消毒方法,70%酒精擦拭静脉穿刺部位待30秒以上1%2%碘酊作用30秒或10%碘伏60秒70%
9、酒精脱碘,47,血液标本的采集要点,抗生素使用前发热初期或高峰时采血量：成人:8-10ml/瓶，儿童:0.5-3ml/瓶采血次数：成人一般为23次防止皮肤寄生菌或环境微生物引起的污染原则上每次采样应需氧和厌氧同时抽尽量不在静动脉导管中取血培养标本,48,菌血症或败血症:10分钟不同的两处采血急性心内膜炎:1-2小时内分别在3处采血亚急性心内膜炎:每隔15分钟分别从3个部位取血,24小时后如为阴性,再取3个标本不明原因发热:间隔1小时以上在不同部位取血2-3份,24小时后如为阴性再取血2-3份怀疑菌血症或真菌血症：结果持续阴性，提醒微生物室进行有针对性培养，以便获得罕见或苛养微生物,血液标本的采
10、集要点,49,痰标本的正确采集,在医生或护士指导下取样嘱病人漱口三遍以除去浅表固有定植菌指导病人深咳以取得下呼吸道标本（而不是鼻后粘液）置于一无菌容器 注意:咳痰不能做厌氧培养!,细胞学筛选标本,不合格标本指唾液或唾液严重污染的痰标本，含鳞状上皮细胞多，而白细胞少,合格标本 应是从下呼吸道咳出的痰，内含颊部鳞状上皮细胞少，而白细胞较多,51,原始培养生长菌落,实现标本退检制度,52,2005年3-5月全院痰标本细胞学筛查合格率调查表,合格:每低倍镜视野上皮细胞25基本合格:每低倍镜视野上皮细胞10个,白细胞25个不合格:每低倍镜视野上皮细胞10个,白细胞25个,53,3-5月我院各病房痰标本合
11、格率调查表,54,清洁中段尿标本的正确采集要点,培养前最好停用抗生素48-72小时 晨尿最佳采集标本前,清洁尿道口。弃去前段尿，留取中段尿于专用培养杯中，盖严培养杯，2小时内送检注意:清洁中段尿不适合做厌氧培养!,55,标本的及时运送,苛养菌中除卡他莫拉菌外，流感嗜血杆菌和肺炎链球菌对干燥、对寒冷的抵抗力均较弱，在标本离开机体后其存活率十分低。对环境抵抗强的病原菌（绿脓及其它G-菌，葡萄球菌、念珠菌等），2-4h后繁殖数代，影响定量结果。,56,正确解读临床微生物室报告,了解细菌体外药敏试验方法认识几种重要的耐药模式,57,病原学检验报告的解释,有无阳性检测结果感染，污染？耐药药物可供选用的治
12、疗药物,58,抗生素敏感试验方法,K-B法（纸片琼脂扩散法）稀释法（肉汤试管稀释法、微量肉汤稀释法、琼脂平板稀释法）E-test法,手工法：自行制订药敏菜单自动化药敏分析系统 全自动：VITEK-AMS、MicroScan、Phoenix、SENSITITRE 半自动：VITEK-ATB、AutoScan-4、AutoReader,59,KB法药敏试验流程,KB纸片法药敏结果,61,K-B纸片琼脂扩散法优点,操作简单（需要的设备简单）、成本低根据需要联合药敏（临床耐药菌增加）判断两药是（无关、协同、累加、拮抗）细菌浓度影响药敏的程度略小能检出接种菌中的异型耐药菌株或混合菌药物选择灵活,62,间
13、接测出MIC（定性）不适合扩散慢的药物不适合生长慢的细菌劳动量大,K-B纸片琼脂扩散法的缺点,加强纸片管理（做好包藏、质控）、琼脂厚度及细菌浓度的控制，对部分有争议的药敏结合MIC法,63,试管稀释法（MIC ug/ml）,0.125 0.25 0.5 1 2 4 8 16 32 64,A 抗生素,E,F,B,C,A,D,MIC,肺炎链球菌E-TEST结果,66,绿脓杆菌鉴定药敏板条结果,生化反应区,药敏测试区,67,稀释法药敏试验（MIC）临床常用自动化仪器优点,定量（直接测MIC），稀释法特别是琼脂稀释法被誉为金标准。敏感度高、出结果快 劳动量相对小现在的自动化仪器（DADE、VITEK-
14、ATB、VITEK-2、Phoenix）都带有专家系统协助判断药敏,68,抗生素敏感试验,药敏结果 临床疗效：敏感有效 耐药无效 敏感无效（假敏感）耐药有效（假耐药）临床医师正确评价药敏试验结果的同时，必须参考病人机体状况、临床治疗效果以及药动学、药物毒副作用和药物价格以及本地区本医院等细菌耐药监测数据合理选用药物。,微生物实验室检验报告单 标本号20030827XJS212,姓名 金雨困 性别 男 年龄 77岁住院号 392745病区 重监 病房 ICU 床号 15诊断 脑梗塞伴肺部感染标本 痰 部位 检验目的 细菌检测（套）送检医师 苏立达 日期 2003/08/27接收医师 徐志刚 日期
15、 2003/08/27直接涂片镜检评价：备注 S-敏感 I-中介 R-耐药,细菌名 混丛，多 阴沟肠杆菌 药敏结果（KB法）抗生素 结果 抗生素 结果氨苄西林 R 6 头孢吡肟 S 27哌拉西林 R 16 亚胺培南 S 23头孢夫辛 R 6 美罗培南 S 24头孢西丁 R 6 庆大霉素 S 19头孢噻肟 R 14 阿米卡星 S 20头孢曲松 R 13 环丙沙星 S 32 头孢他定 R 10氨曲南 R 15 阿莫西林/克拉维酸 R 6 哌拉西林/他唑巴坦 R 16头孢哌酮/舒巴坦 I 18,第 1 张 共2 张报告单 报告日期 2003-08-30 检验医师：审核：,微生物实验室检验报告单 标本
16、号20030409XJS045,姓名 衬丙丙 性别 男 年龄 59岁住院号 384802病区 重监 病房 ICU 床号 8诊断 多发伤伴肺部感染标本 痰 部位 检验目的 电脑细菌检测（套）送检医师 李立斌 日期 2003/04/09接收医师 徐志刚 日期 2003/04/09直接涂片镜检评价：备注 S-敏感 I-中介 R-耐药,细菌名 混丛，多大肠杆菌 药敏结果抗生素 结果 MIC 氨苄西林 16 R哌拉西林 64 R头孢夫辛 16 R复方新诺明 2/38 S头孢噻肟 4 S头孢曲松 4 S 头孢他定 8 S 氨曲南 8 S 亚胺培南 4 S,第 1 张 共2 张报告单 报告日期 2003-0
17、4-12 检验医师：徐志刚 审核：原双晋,71,Serious infections testing positive for MRSA isolates among hospitalized patients(1997 SENTRY data),Patients(%),0,30,50,10,Pneumonia,20,40,UTI,Wound,Bloodstream,Infection type,Jones.Chest 2001;119:397S404S,UTI,UTI=urinary tract infection,据NCCLS（2004）标准：苯唑西林 MIC4mg/L MRSA MIC2
18、mg/L MSSA 头孢西丁 30g/片 19mm MRSA 24 mm MRCoNS凡MRS菌:不管其实验结果MIC值或抑菌环大小如何，实验室均应报告该细菌对所有-内酰胺类耐药 以免误导临床用药。,MRSA的确定,MRSA分离率,41.2%,24.2%,2.4%,60%,0%,50%,100%,日本(1999)5,欧洲(1993)4,韩国(1988)2,美国(NNIS)(1975)1,日本(1993)3,56%,1、Data:File on Lilly Laboratory,Indianapolis,U.S.A.2、J Korean Med Sci,1998;3:4550.3、J Derma
19、tology,1993;20:1931974、Vincent et al.JAMA,1995;274(8):639644.5、Morimotok,Kansenshogaku Zasshi-Journal of the Japanese Association for Infectious Disease 73(6):58492,1999 Jan,74,华西医院MRSA的检出率,资料：四川大学华西医院,75,Structurally modified antibiotic target site,Interior of organism,Cell wall,Target site,Binding
20、,Antibiotic,Antibiotics normally bind to specific binding proteins on the bacterial cell surface,76,Structurally modified antibiotic target site,Interior of organism,Cell wall,Modified target site,Antibiotic,Changed site:blocked binding,Antibiotics are no longer able to bind to modified binding prot
21、eins on the bacterial cell surface,77,用药选择：,全身性感染：首选万古霉素、去甲万古、替考拉宁 可联用利福平、氨基糖苷类,链阳菌素类、恶唑烷酮类,78,Patients who failed cephalosporin therapy for serious infections due to ESBL-producing organisms,Paterson et al.J Clin Microbiol 2001;39:22062212,Clinical failure rate(%),0,60,100,20,1,40,80,2,4,8,Cephalos
22、porin MIC(g/mL),常见ESBLs产生菌及药敏特点：,肠杆菌科：常见克雷伯菌属、大肠埃希菌 对 PNC类、1-4 代头孢 R，多为 MDR 头孢他啶、头孢曲松、头孢噻肟或氨曲南的抑菌圈减小 加 克拉维酸（棒酸）可使抑菌圈扩大 5mm,80,ESBLs筛选试验 确认试验（纸片法）,纸片 头孢他定 30g 头孢他定/棒酸 30/10g 头孢噻肟 30g 头孢噻肟/棒酸 30/10g接种 MHA标准纸片扩散法，孵育 35，空气，16-18h结果 头孢他定 22mm 加棒酸后抑菌圈直径 头孢噻肟 27mm 5 mm 为ESBL株,81,ESBL确证实验,82,ESBLS分离率,国外10%-
23、40%国内30%-45%华西医院：,83,Mechanism of ESBL activity,Parent-lactamase,Third-generationcephalosporin,No fit;therefore,no enzymatic destruction of antibiotic,84,Mechanism of ESBL activity,Third-generationcephalosporin,ESBL,Enzyme fit leads to destruction of antibiotic,由质粒介导，系窄谱-内酰胺酶基因突变而来 TEM-1，TEM-2和SHV-1等,谢谢大家！,联系电话：85422618E.mail:,
