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1、沈佐君,乙型肝炎患者抗病毒治疗拉米夫定耐药性突变检测,拉米夫定(Lamivudine),硫代脱氧胞嘧啶（2-deoxy-3-thiacytidine，3TC）核苷类似物口服抗病毒药物英国葛兰素威康制药公司推出的贺普丁(heptodin)在2000年已被国家药品监督管理局批准列入国家基本药物制剂品种目录，1998年被FDA批准用于临床。,拉米夫定的作用,降低HBVDNA的浓度改善肝脏组织的病变可能阻断肝纤维化的进程，终止肝硬化的发展不受人种、病毒感染的模式、野生型或基因组前C区突变的影响口服，副作用小,抗病毒机制,竞争性阻断逆转录酶（依赖RNA的DNA多聚酶）活性，有效地抑制HBV的复制进入细胞
2、的拉米夫定在激酶的作用下可被磷酸化为三磷酸脱氧胞苷，可以与dCTP竞争性掺入延伸的DNA，因它缺乏3羟基而使复制的病毒DNA链终止。,为什么在使用拉米夫定(Lamivudine)要进行YMDD检测?,拉米夫定治疗HBV感染治疗过程与YMDD变异关系,引自J Virol.Metods 1999；83：181-187,YMDD变异的耐药机制,第552位的蛋氨酸（M）被缬氨酸（V）或异亮氨酸（I）替代后，使此侧链缩短，结合位点变大，不再适合拉米夫啶结合而导致耐药。变异株对拉米夫啶的敏感性大大降低。体外实验证实该药物抑制变异株HBV复制的效率可降为对野生株的万分之一。,YMDD突变,Met-ATGYM
3、DDVal-GTGYVDDYVDDIle-ATTYIDD,拉米夫定治疗中的突变发生位点,YMDD编码DNA多聚酶（CODON552）,YMDD 野生株：Tyrosine-Methionine-Aspartate-Aspartate（YMDD）（酪氨酸）-（蛋氨酸）-（天门氡氨酸）-（天门氡氨酸）变异株1：Tyrosine-Valine-Aspartate-Aspartate（YVDD）（酪氨酸）-（缬氨酸）-（天门氡氨酸）-（天门氡氨酸）变异株2：Tyrosine-Isole-Aspartate-Aspartate（YIDD）（酪氨酸）-（异亮氨酸）-（天门氡氨酸）-（天门氡氨酸）,YMDD变
4、异检测方法有：1、测序：金标准，需昂贵仪器设备，成本高，过程复杂2、基因芯片：技术目前尚未成熟，仍需进一步研究3、限制性片段长度多态性：目前临床用得最多的是RFLP，但由于病毒变异快速，即使有轻微的碱基变化，就会出现RFLP酶切位点的变化，出现新的酶切位点或原有的酶切位点消失，导致检测失败。而且RFLP完全依靠凝胶电泳来判断结果，敏感性较差，假阴性率较高。该法对HBV混合型耐药株感染显得束手无策4、荧光定量real-time PCR：该技术为核酸的检测提供了新的技术手段,YMDD突变检测常见方法,1.基因测序法（标准的参考方法）2.荧光定量PCR方法（实用的方法）,基于我国医疗机构实验室开展实
5、时荧光PCR检测十分普遍，这些实验室都拥有荧光定量PCR分析仪。故此，建立了一种新的适应这类设备的实时荧光PCR方法，应该符合中国的国情。,荧光定量PCR检测YMDD,基本原理：确定探针特定的TM值来区 分是否突变。常用方法：覆盖突变位点荧光双探针杂交的方 法检测YMDD。TM值：在核酸加热变性过程中，当双链DNA 解链到一 半时所对应的温度就是该核 酸的TM值，也叫核酸的熔点。每种不 同的核酸有不同的TM值(特征常数)。,影响TM值的主要因素,1.碱基中GC含量，含量越高，TM越大。2.核酸的长度，核酸越长，TM越大。3.完全配对比不完全配对时TM值要大。,溶解曲线分析（Tm）,YIDD,Y
6、MDD,YVDD,YMDD+YIDD,加热核酸时荧光强度变化曲线，当荧光陡变为0时所对应的温度就是TM值。,同样的核酸序列不同浓度TM值相同,不同核酸TM值不同,YMDD突变的熔解曲线检测原理,YMDD：TM值显示54.64C,YIDD：TM值显示46.91C,YVDD：TM值显示50.74C,46.91C 54.64C 50.74C,YIDD YMDD YVDD,临床资料,标本 2005年9月-2006年12月来省立医院感染科就诊的慢性乙肝患者187例，接受拉米夫定用药20天-36个月，年龄12-66岁，男性110人，女性77人。其中HBV-DNA103 C0PIES/ML157例，HBV-
7、DNA含量为 2.0103-8.0108 C0PIES/ML，HBV-DNA103 C0PIES/ML 30例。试剂 乙肝病毒核酸荧光PCR检测试剂购置中山大学达安基因股份有限公司，荧光PCR检测通用试剂和HBV-DNA提取试剂由上海复星医学科技发展有限公司提供，引物及探针由上海百曼生物技术有限公司合成。,项目开展情况,ATG:rtM204（正常）,GTG:rtM204（V变异）,ATT:rtM204（I变异）,ATT/GTG:rtM204(I/V双杂合子峰),我们用实时荧光定量PCR方法检测187例临床乙肝患者血清标本，观察HBV的YMDD变异情况，同时用测序法作为金标准比对验证。结果表明，此方法在临床YMDD变异诊断中具有快速、灵敏和特异的特点。,结 论,
