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1、项目十一,细胞培养,教学目标,工作任务,实践操作,问题探究,知识拓展,作 业,教学内容,教学终极目标,会进行细胞培养,会对分离的细胞进行培养会应用分离单细胞和单细胞培养的基本方法,促 成 目 标,项目介绍,指对从植物器官或由愈伤组织上分离的单细胞（或小细胞团）进行培养，形成单细胞无性系或再生植株的技术。,植物细胞培养,Haberlandt：,高等植物的组织和器官可以分割成单个细胞,利用植物细胞培养可以获得植物有用的代谢产物，也可以进行突变体的诱导和选择，还可以对植物的生理生化进行研究。本项目以天蓝苜蓿为材料，阐述了细胞培养的技术。,一、天蓝苜宿愈伤组织诱导 用浓硫酸浸泡种子5min后，再用0.
2、1%升汞溶液灭菌3min。无菌水冲洗4次后，将种子接种在不含激素的固体MS培养基上。种子萌发3天后切取子叶和胚轴。外植体切成12mm的切段，接种在培养基上诱导愈伤组织。愈伤组织诱导在暗培养中进行，温度为271。,实践知识,当子叶和胚轴外植体诱导出的愈伤组织长到5mm大小时，转入液体培养基中进行旋转式振荡培养(120r/min)。每周换液一次。培养四周后，用400门镍丝网过滤悬浮细胞液，倒置显微镜下检查和统计不同细胞系的细胞密度。过滤后的悬浮细胞液静置1小时，待细胞完全沉淀后，倒掉上清液，加入培养基将细胞悬浮液的细胞密度调到104个/ml。,二、单细胞分离和收集,单细胞培养,制备单细胞:,细胞分
3、离,获得单细胞的途径由完整的植物器官分离单细胞由培养组织（如愈伤组织）中分离单细胞,利用机械的方法使叶肉细胞得到分离的技术。撕去叶表皮，暴露叶肉细胞，然后用解剖刀把细胞刮下来,离体细胞可直接种在液体培养基中培养。先将叶片组织轻轻研碎，再通过过滤和离心将细胞纯化.研钵中放入10g叶片和40ml介质（20mol蔗糖，10molMgCl2、，20mol Tris-HCl缓冲液，pH7.8）轻轻研磨，然后将匀浆用两层细纱布过滤，滤液经低速离心，使游离细胞沉降到试管的底部，得到纯化的细胞。,液体培养,说明：只有薄壁组织排列松散、细胞间接触面很小时，用机械法分离叶肉细胞才能取得成功。,机械法,用纤维素酶和
4、果胶酸酶从组织分离,利用纤维素酶果胶酶使细胞间的中胶层发生降解，分离出具有代谢活性的细胞的技术。,酶解法的特点：能得到比较均匀一致的海绵组织细胞或栅栏组织细胞。但在使用该法分离细胞时，必须对酶溶液给予渗透压保护,防止细胞的胀裂。,液体培养,酶解法,注意：大麦、小麦和玉米，很难通过酶解法使细胞分离。因为叶肉细胞较长，并在许多地方收缩，细胞间有链状互锁结构阻止细胞的分离。,机械法和酶解法比较机械法：1、细胞不会受到酶的伤害；2、质壁不会分离；3、细胞产量低；4、细胞易破坏。酶解法：1、细胞会受到酶的伤害；2、质壁可能分离；3、细胞产量高；4、细胞不易破坏。,小麦,把未分化和易散碎的愈伤组织转移到装
5、有液体培养基的三角瓶内，将这些悬浮培养物在摇床上进行振荡培养，并得到游离细胞。,1）诱导产生愈伤组织；2）愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织松散性；3）将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物.,茎段,愈伤组织或悬浮培养物(常),优点：细胞团成小细胞团或单细胞；在培养基中均匀分布；有空气交流。,振荡的作用：对细胞团施加一定的压力，使之破碎成小细胞团或单细胞。促进培养基和容器内空气之间气体交换，保证细胞正常代谢。,取5ml悬浮细胞液置于直径5cm的玻璃培养皿中进行静止的浅层液体培养。培养皿置于培养箱中进行暗培养，温度为27士1。每隔10天加入23ml新鲜培养基。当愈伤组织长到12
6、mm时，统计每个培养皿中形成愈伤组织块的数量，并将愈伤组织转入固体培养基上进行增殖。当愈伤组织增殖到45mm时，培养基上进行分化培养。,三、单细胞培养,平板培养法,单细胞培养方法,用途：诱导形成单细胞系。,含义：指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。,看护培养的含义及用途,用同种或异种材料的愈伤组织作为看护组织来培养细胞的一种方法。就是把单细胞放在一块活跃生长的愈伤组织上进行培养，在愈伤组织和培养的细胞之间有一层滤纸相隔。,（一）、看护培养法,（1）在一个培养瓶中加入一定量厚的固体培养基，灭菌后备用。（2）在无菌条件下，将一小块（1cm3）活跃生长的愈伤组织接种到培
7、养基上，再在愈伤组织块上放一片（1cm）已灭菌的滤纸，放置一晚上。（3）将分离的单细胞接种到培养基的滤纸上。（4）恒温培养。,看护培养基本技术,看护培养图示：,单细胞无性系,恒温培养1个月,23月,用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使其生长和增殖。这个愈伤组织称块为看护愈伤组织,优点：（1）简便易行。（2）效果好，易于成功。缺点：（1）不能在显微镜下直接观察细胞的生长过程。,3、看护培养特点：,离体单细胞在直接培养技术下不分裂，看护培养则分裂的原因：看护愈伤组织给单细胞提供了培养基的营养成分和促进细胞分裂的其它活性物质。,1 微室培养的含义及用途,用途:主要用来观察细胞生长、分裂、形成
8、细胞团的过程。,含义:将单细胞培养人工制造的一个小室中（少量的培养基中）进行培养。,（二）、微室培养法,微室培养图示：,1滴含单细胞培养液,周围加石蜡油,凹穴载玻片,旁边加石蜡油,盖盖玻片,盖盖玻片,平视图,微室培养要求：微室内不能有气泡。微室的厚度最好不要超过20微米，盖玻片的厚度要在0.17-0.18mm左右。观察时要保持温度和培养时一致。,2 微室培养特点：,优点：（1）在培养过程中，可以连续进行显微观察一个细胞的生长、分裂和形成细胞团的全部过程缺点：（1）培养时间较短,1、含义及用途：,含义:将单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合后平铺一薄层在培养皿底上的培养法。,（三）、平板培养法,用
9、途:分离单细胞无性系，研究其生理、生化、遗传上的差异而设计的一种单细胞培养技术。广泛应用于细胞、原生质体及融合产物的培养。,(1)、悬浮细胞密度的调制 平板培养要求最初细胞密度（即初始植板密度）为110-10010 个/ml。,3 平板培养的基本技术,初始植板密度：单细胞固体平板培养时，细胞悬浮液接种到琼脂培养基上最初细胞密度,A.直接配制1.4%琼脂基本培养基B.1.4%琼脂基本培养基+等量细胞培养液=0.7%琼脂条件培养基。,（2）培养基配制,（3）制平板：细胞悬浮液与融化状态（35）条件培养基按一定比例均匀混合，倒成平板。,(4)培养：26置暗处培养21天。低倍显微镜观察，记数单细胞或小
10、细胞团，计算置板效率（也称植板率）。,小细胞团计数方法：1）低倍显微镜直接计算；2）细胞团显影法,植板效率（或植板率）：已形成细胞团的百分数（即每100个铺在平板上的细胞中有多少个能长出小细胞团）。,显影仪,平板培养应注意的问题：（1）选用的培养基必须是能够在低的细胞起始密度下使细胞生长。（2）不要选用处在静止期过久的细胞。（3）在固体培养基中适宜的起始密度因植物种类而不同。如：烟草细胞适宜的为5-10103/ml（4）接种时固体培养基的温度要严格控制，一般不超过35，温度低对细胞伤害小，但操作困难，凝固快会造成细胞分布不均。,条件培养基培养 在培养基中加入高密度的细胞进行液体培养，一定时间后
11、这些细胞就会向培养基中分泌一些物质，过滤掉其中的细胞，将这种这种培养基再制成液体或固体培养基来培养单细胞或细胞团，这样可明显提高单细胞培养物的存活和分裂的能力。液体浅层培养 将悬浮培养液中的细胞过滤，得到游离单细胞和小细胞团 在浅层液体培养基中培养。用途：主要用来增殖细胞。特点：有利于有毒物质的扩散；有利于气体交换；不利于定点观察；单细胞生长、分裂后，难以得到单 细胞系。,条件培养基：曾悬浮培养过一段时间组织或细胞的液体培养基。,培养细胞的计数和活力测定如何进行？（一）原理 1.计算细胞数目 可用血球计数盘或是Coulter counter 粒子计数器自动计数。2.血球计数盘 一般有二个cha
12、mbers，每个chamber 中细刻9个1mm2 大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1 mm。当chamber上方 盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2x0.1mm=1.0 x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。,问题探究,3.存活测试原理 是利用染料会渗入死细胞中而显色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会显色来测定活力的。一般使用蓝色之trypan blue 染料，如果细胞不易吸收trypan blue，则用红色Erythrosin bluish。,1、条件培养基2、细胞密度(临界密度
13、)3、生长激素4、pH5、CO2,影响单细胞培养的因子,问题探究,细胞悬浮培养（Suspension culture),含义及特点,2、特点（1）细胞可不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养；（2）能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。,1、含义：将离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行的无菌培养,相关阅读,一、悬浮培养类型和方法,连续培养,成批培养,注：悬浮培养中既有单细胞，也有细胞团。起始悬浮液的制备 愈伤组织 液体培养基 摇床振荡 转速30-150rpm 2-3cm冲程防细胞破裂 悬浮培养 要求：质地疏松，细胞分散程度大。（质地紧密，细胞分散程度小，不适
14、于悬浮培养）,（一）成批培养/分批培养（Batch culture）,含义：将愈伤组织培养在一定容积的密闭容器中进行培养。它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方法。,（1）培养基体积固定；（2）必须适当搅拌；（3）培养过程中，细胞生长，其数目不断 发生变化，呈S增长；（4）但要进行下一批培养，则生长一定时 间后，需要继代转移。,2、成批培养的方法,(1)旋转培养(2)往返震荡培养(3)旋转震荡培养(4)搅动培养,1、成批培养特点,细胞生长曲线,延滞期：细胞很少分裂，细胞数目增加少。对数生长期：细胞分裂活跃，数目迅速增加。直线生长期：细胞增殖最快时期，单位时间内细胞数目增长大致恒定
15、,细胞数目达到最高峰。缓慢期：培养基中某些营养物耗尽，或是有毒代谢物的积累，增长速度逐渐变慢。静止期生长趋于完全停止。,（二）连续培养,含义：指在培养过程中，以不断抽取悬浮培养物并注入等量新鲜培养基，使培养物不断得到养分补充，保持其恒定体积的培养。,（1）新鲜培养基的不断加入,保证了养分的充分供应；（2）可使细胞保持在增殖旺盛的对数生长期中；（3）适于大规模工业化生产,1、连续培养的特点：,(1)半连续培养：每隔一定时间倒出一定量的悬浮液，同时补充加入等量的新鲜培养液(2)连续培养：不断注入新鲜培养基，排掉旧的培养基,2、连续培养的种类：,半连续培养,利用培养罐进行大量细胞培养的一种培养方式。
16、当培养罐内细胞数目增殖达到一定数量后，将1/2的细胞悬浮液倒于另一个培养罐中，分别添加新鲜培养基继续培养。该培养方法能重复地获得大量均匀一致的培养细胞。,半连续培养,加入培养基,排出培养基及其培养物,连续培养图示：,利用特制的培养容器进行大规模细胞培养的一种培养方式。特点：不断注入新鲜培养基，排掉旧的培养基，可以保证养分的充足供应，不会出现悬浮培养物发生营养亏缺的现象。可在培养期间内使细胞长时间保持在对数生长。适于大规模工厂化生产。,细胞的工厂化生产,工厂化生产途径的3个步骤：1.高产细胞株的选择 将所分离纯化的细胞群，以一定密度接种进行平板培养,根据不同培养目的对其进行鉴定和测定，从中选择出
17、高产、高品质的单细胞无性系。2.“种子”培养 对高产的细胞株或细胞无性系进行扩大繁殖，目的是获得培养细胞来用做大量培养时的接种材料。3.细胞的大规模培养 将选择的目的单细胞无性系，用发酵罐或生物反应器进行工厂化细胞培养以生产所需要的化合物。,细胞培养主要应用,1、植物有用物质的生产2、诱发和筛选突变体3、原生质体培养和细胞分离4、食品生产。,问题探究,（一）植物次生代谢产物的生产 细胞培养生产次生代谢产物的特点:1、不受季节变化、土地制约、地域气候条件的影响；2、可以人为控制培养条件、提高次生代谢产物的产量；3、可排除病菌、虫害的影响；4、利于大规模工业化生产。（二）进行特定的生物转化反应 生
18、物转化：通过一系列生理生化反应，将天然有机物产物转化为新的化合物或提高该物质的产量的过程。例如，高辛、茛菪碱等合成。,天然化合物的生产与转化,例如在培养基中加入不同浓度的NaCl，通过胁迫诱变和筛选抗盐突变体。还可以向培养基中加入病原体的毒蛋白，以诱变和筛选抗病突变体。为了改善作物品质，可以进行抗赖氨酸类似物的诱变与筛选，即在培养基中加入不同浓度的赖氨酸类似物，可以获得抗赖氨酸类似物突变体。这种突变体中的赖氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的水平升高。总之，借助植物的细胞培养，可以从多途径上用于作物的改良研究。,细胞突变体的诱变与筛选：,思考题1.什么是细胞培养？细胞培养的方式有哪些？各有什么优缺点？2.细胞悬浮培养定义？成批培养的几个时期是什么？连续培养是选用的那个时期？3.细胞悬浮培养有哪些用途？,谢谢!,
