《细胞凋亡手册.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细胞凋亡手册.ppt（44页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、,联科生物技术有限公司,细胞凋亡分析-1-,细 胞 凋 亡 检 测,cell,apoptosis,detection,流式细胞术细胞凋亡快速检测试剂盒,BMS306FIANNEXIN V,rh Annexin V FITC KITrh Annexin V FITC KIT,300 test200 test,50004880,BMS306FI/100T rh Annexin V FITC KIT,100 test,2850,BMS306FI/c,rh Annexin V FITC KIT,020 test,1300,技术支持：免费电话：8008282330 8008571184,电子邮件：传真电
2、话：86 512 68668874,联科生物技术有限公司,细胞凋亡分析-2-,细胞凋亡检测技术与方法凋亡现象的分析（一）细胞凋亡一词来源于，原文是希腊文，的意思是从，的意思是落下。原意表示树叶从树木上落下，读时第二个 不发音，又称细胞程序性死亡（、），是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程。它是一个主动的，高度有序的，基因控制的，一系列酶参与的过程。细胞凋亡与有丝分裂相对，是生物体中一种普遍存在的现象。胚胎形成；衰老和损伤细胞细胞的清除；自身反应性 淋巴细胞的清除以及肿瘤的发生、发展和转归；干细胞在最终分化到成熟的血细胞的一系列过程中，并非每个细胞都能够走到终点
3、，相当一部分细胞，甚至绝大部分细胞都会在中途凋亡；胸腺的 细胞 存活不到成熟 细胞阶段；相当数量的原始和幼稚红细胞在骨髓中发生“原位溶血”；这些生理或病理过程都与细胞凋亡密切相关。细胞凋亡在形态和生化上有其明显的特征（见图-1）。在形态上，早期细胞核固缩、染色体边集在核膜内侧显新月体形、核碎裂；细胞浆和细胞器密度增高、细胞体积变小；细胞膜皱折、卷曲，但早期细胞膜的完整性未受到破坏。最明显的特征是 与 依赖的骨源性核酸酶的激活，使细胞核染色体从核小体间断裂，形成由大约为 或其多聚体组成的寡核苷酸片断，琼脂糖凝胶电泳上形成特征性的“梯状带”（见图）。图1细胞凋亡概念提出至今还不到 年的时间，但由于
4、它在保证多细胞生物的健康生存过程中扮演着关键角色，及在病理学研究中的重要作用，引起了人们对其机制广泛而深入地研究，成为目前生命科学界最为热门话题之一，也是生命科学界乃至社会各界争相投入的研究领域。,技术支持：免费电话：8008282330 8008571184,电子邮件：传真电话：86 512 68668874,联科生物技术有限公司,细胞凋亡分析-3-,从近年的 排名中我们可以看到，信号传导方面的文章远远超过位于第二位的人类基因组方面的，而信号传导中一个重要的前沿领域就是细胞凋亡的研究。随着这方面研究的持续升温，涌现出了大量新的技术和方法对细胞凋亡进行检测，其中不少已经有商品化的产品出现，大大
5、加速了研究的进程。具体来说，针对凋亡的不同阶段有以下一些方法。,第一部分,细胞凋亡的形态学分析,在细胞凋亡的发展过程中，最明显的实验证据是在光学显微镜和电子显微镜下观察到的一些形态学变化。与细胞坏死时细胞肿胀、胞膜破裂和胞质溶酶体释放等引起的炎症反应的现象相反，凋亡的共同特征是细胞收缩，以细胞核的形态改变尤为突出，但并不引起炎症反应。光镜下，凋亡细胞体积缩小，染色质密聚集成斑块状。在组织内，细胞凋亡典型特征是影响并出现于单个细胞，且凋亡的细胞周围有环状带。用相差显微镜（，）可清楚地见到凋亡细胞的发泡（）和凋亡小体（）。电镜下，凋亡细胞的变化更富有特征性。开始时，凋亡细胞体积缩小，失去细胞连接（
6、）和一些特殊膜表面结构，如微绒毛（）的消失，染色质浓集并靠近于核膜，列成沿核膜收缩的新月状体，细胞与邻近细胞、组织失去接触，但细胞膜、线粒体、高尔基体等细胞器保持完整。然后，核体积近一步缩小，并可裂解为一个或数个致密体，其与一定核糖体及各种细胞器成份形成具有完整膜性结构的凋亡小体。随之，凋亡细胞或凋亡小体由邻近正常细胞或吞噬细胞识别、吞噬。利用扫描电镜（，）可更加客观、真实地观察到凋亡细胞表面泡状突起的形成。以电镜结合定量数字式影像技术可观察到凋亡细胞核浓缩时的细微变化，以碘化丙啶（，）对细胞核进行染色，激光共聚焦（，）能十分清楚地对凋亡细胞固缩的染色质及核碎片进行定位。现在有人利用缩时摄影术
7、（）对细胞凋亡的整个过程进行动态观察，这被认为是检测细胞凋亡形态学的金标准，因其可排除其它形态学观察中因人为假象而使形态学指标不能重复。另外，用流式细胞仪（，）也可进行形态学分析。表 1 检测细胞凋亡的形态学方法比较,检查方法光学显微镜（）相差显微镜（）透射电镜（）激光共聚焦（）扫描电镜（）流式细胞术（）缩时摄影术（）,可鉴定凋亡细胞的特征细胞体积缩小、核浓缩、细胞周围透明圈细胞鼓泡、凋亡小体微绒毛消失、核染色质沿核膜分布、新月体形成、凋亡小体凋亡细胞固缩染色质及核碎片定位细胞表面泡状突起低前向散射光（）、高侧向散射光（）凋亡细胞的形成过程,凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。在流式细胞
8、仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因,技术支持：免费电话：8008282330 8008571184,电子邮件：传真电话：86 512 68668874,C,联科生物技术有限公司,细胞凋亡分析-4-,此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判
9、断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。也可用于活细胞的分类。【操作方法】（1）离心收集 1106 个细胞；（2）用 PBS 重悬细胞，200g 离心 5 分钟，弃上清；（3）缓慢重悬细胞于冷乙醇（-20C）中（逐滴加入，每分钟不超过 1ml）；（4）在冰中孵育至少 30min（标本可在 4 保存一周）；（5）200g 离心 5 分钟
10、，弃上清；（6）重复（2）；（4）重悬细胞于 1ml PBS 中，上机检测。图在前散射光对侧散射光的散点图或地形图上（见图），凋亡细胞与正常细胞相比，前散射光降低，而侧散射光可高可低，与细胞的类型有关。在细胞凋亡形态鉴定的各种方法中，除流式细胞仪外，其它检测手段均不能很好地对凋亡作定量分析，而且，费时、费力、重复性欠佳（除缩进摄影术外）。但是，该法检测对象必须是活细胞才有意义，而且此参数无特异性，因机械性损伤、分离、不同固定液及时间均可改变细胞形态造成细胞光折射率的改变。,第二部分,细胞膜结构改变分析,胞膜完整的活细胞对阳离子染料如台盼蓝（）、碘化丙啶（）、溴化乙锭（，）、氨基放线菌素（，）、
11、叠氮溴化乙锭（，）等有拒染能力，但死细胞（包括凋亡后期的继发性坏死细,技术支持：免费电话：8008282330 8008571184,电子邮件：传真电话：86 512 68668874,联科生物技术有限公司,细胞凋亡分析-5-,胞、机械损伤细胞、本身为坏死的细胞）可被上述染料标记。这些染料通常用于检测细胞活力，其中 是 分析与区别凋亡与坏死细胞最常用的荧光染料。同时，这些方法可与细胞免疫标志同时进行，简单易行，但染料浓度、作用时间及温度因细胞而异，同批实验需条件一致。需指出的是，细胞凋亡的早期由于细胞膜尚完整，但可出现细胞膜转运功能一过性的损失，这个阶段凋亡细胞与正常活细胞相比，可对上述几种荧
12、光染料的摄取量增加，但又不如凋亡后期细胞那样明显或深染，如结合其它方法，可较好地区别早期或晚期的凋亡细胞和正常活细胞。利用对正常和凋亡细胞跨膜通透性不同（也可能还与凋亡细胞 染料结合能力有关）的两种 染料同时染细胞，为鉴别凋亡或坏死细胞提供了较好的方法。吖啶橙（，一种膜通透性较高的染料）和 双重染色方法应用较多。对正常细胞，将其染为强绿色，染色较弱，对凋亡细胞，染色仍为阳性，红染轻度增加，对坏死细胞，红染色明显增强，染色却变暗（诱导 荧光淬灭）。双笨并咪唑染料（）与 两种荧光染料分别与凋亡细胞与坏死细胞染色，因正常活细胞对两种染料都有拒染性，凋亡细胞有膜通透性改变，主要摄取 染料，并与 结合在
13、紫外光下呈蓝色荧光，而 或 染色阳性的细胞为坏死或凋亡后期继发性坏死细胞。通过 分析后可在细胞直方图中，用蓝色（）对红色（）将细胞分为正常，凋亡和坏死细胞。现有两种 染料，即 和，前者不能被正常细胞摄取，仅被凋亡细胞摄取，因此，在区别凋亡细胞时更好。须注意的是，以带电或不带电荷的荧光染料检测分析凋亡或坏死细胞膜通透性改变时，由于细胞种类、凋亡了展阶段、凋亡诱导类型的不同，使凋亡发生的不同细胞之间的最佳条件如凋亡细胞摄取荧光染料的浓度、孵育时间及温度等可显著不同。一、方法荧光素乙酸盐（，），本身不是荧光染料，但可以被活细胞摄取，并由细胞内的乙酰酶水解，水解后的产物荧光素（）贮留于细胞内显很强的荧
14、光。当细胞同 和 孵育后，活细胞为绿色荧光素标记，死细胞为 红染色。二、Hoechst 单染 和 等为膜通透性染料，可使凋亡细胞着色浓密，这可能与凋亡细胞膜通透性增加有关，也有人认为是 糖蛋白泵失活，染料从凋亡细胞运出减少所致。细胞用孵育，由于结合于上的染料增加，激发光移动到长波长区域。这种现象最易观察，记录蓝色和橙色荧光之间的比率（橙色荧光，用检测的滤光片）。在一个含有正常和凋亡细胞的混合体系中，凋亡细胞表现出更大的光谱移动。这样的区别可能是由于有更大的毒性进入凋亡细胞。细胞用孵育不同的时间。显示细胞的橙色和蓝色荧光，观察凋亡细胞群体随着孵育时间的增加荧光相应地长移到橙色区域。凋亡和正常细胞
15、的激发光的变化也可以用蓝橙比例图活细胞设门来观察。实验使用细胞系，乏孵育小时，用染色分钟。流式细胞仪检测，蓝色与橙色荧光双参数图（见图），红色为的正常细胞，蓝色的为凋亡,技术支持：免费电话：8008282330 8008571184,电子邮件：传真电话：86 512 68668874,）,联科生物技术有限公司,细胞凋亡分析-6-,细胞，绿色为死细胞，粉红的为碎片。图三、eochst 33342/PI 双染法 和 双染鉴别凋亡或坏死细胞也被广泛应用。这种方法依赖于活细胞、死细胞、凋亡细胞对 和 两种 染料不同细胞膜通透性。死细胞可通透两种染料，活细胞能够排出两种染料不能染色，凋亡细胞能够排出 但
16、不能排出。【试剂的准备和配制】（）染液：用 配成 的储存液，避光保存。（）染液：用 配成 浓度，避光保存。【染色方法】（）悬浮生长的细胞在培养状态下加入，终浓度为；贴壁生长的细胞用含有 的 胰蛋白酶消化成单细胞悬液，离心，弃上清，用 全培养液重悬细胞，加入，终浓度为，孵育。（）离心弃去染液。（）加入 染液，避光染色。（）目筛网过滤一次。（）流式细胞仪分析，用氪激光激发紫外线荧光，激发光波长为，发射光波长为，产生蓝色荧光；用氩离子激光激发荧光，激发光波长为，发射光波长大于，产生红色荧光。分析蓝色荧光对红色荧光的散点图或地形图。【结果分析】在蓝色荧光对红色荧光的散点图上，结果如下：正常细胞为低蓝光
17、低红光（），凋亡细胞为高蓝光低红光（，坏死细胞为低蓝光高红光（）。【说明】（）在蓝色荧光对红色荧光散点图上，还可见到细胞凋亡区向细胞坏死区迁移的轨迹，可能是细胞凋亡的 进一步降解的缘故。（）这个方法只能适用某些细胞类型（细胞很好）。,技术支持：免费电话：8008282330 8008571184,电子邮件：传真电话：86 512 68668874,联科生物技术有限公司,细胞凋亡分析-7-,（）这个方法是是时间依赖性的，染料与细胞孵育的时间不宜过长，一般控制在 之内为宜。如是太长可引起 的发射光谱由蓝光向红光的迁移，导致红色荧光与蓝色荧光的比例改变，从而影响结果的判断。（）这个方法在染色后应尽快
18、上机检测，因为这样的区别只是在染色后的较短时间内比较明显。【实例一】如图，经地塞米松处理的 细胞，用 染色，然后加入，上机检测。,【实例二】如果用 代替实验中的，那么同时染色两种使用 的细胞表面标记将是可能的。尽管 原来是 激发的染料，用高能量（）的 激光激发它，能够发出荧光。发射波长在 处，这个 的发射光谱有点重叠。用这样的方法，可以检测特殊定义的某群细胞的凋亡状态（见图）。四、与 双染（）是一种红色 染料。凋亡细胞和死细胞因与 着染能力的不同而区别，凋亡细胞和死细胞通过它们对死细胞甄别染料的着染能力差别加以区分（见图）。图,技术支持：免费电话：8008282330 8008571184,电
19、子邮件：传真电话：86 512 68668874,联科生物技术有限公司,细胞凋亡分析-8-,图五、细胞膜表面结构分析在细胞凋亡的早期，细胞膜的某些结构如伪足（）和微绒毛（）消失，使凋亡细胞表面光滑。肌动蛋白（）是伪足的主要成份。毒蕈肽（）是毒性环形多肽，其可以与 结合，利用 毒蕈肽可作为 肌动蛋白的探针。细胞凋亡时两者的结合力减少或丧失。,技术支持：免费电话：8008282330 8008571184,电子邮件：传真电话：86 512 68668874,联科生物技术有限公司第三部分,细胞凋亡分析-9-细胞膜表面标记改变的分析,图图如图7、图-8 所示，正常细胞膜磷脂的分布是不对称的，膜内表面含
20、有带负电的磷脂（如磷脂酰丝氨酸，），而膜外表面含有占绝大多数的中性磷脂。在细胞凋亡早期，细胞表面发生化，细胞膜内部的磷脂酰丝氨酸可迁移到细胞外层表面，巨噬细胞就是通过识别凋亡细胞表面的磷脂酰丝氨酸将凋亡细胞或凋亡小体吞噬，保护机体避免因细胞内部暴露引起的炎症反应。是一种 依赖的，对 有高度亲和力的磷脂结合蛋白，可作为探针识别细胞膜表面是否有，从而识别凋亡细胞。由于坏死细胞也可能在膜表面出现磷脂酰丝氨酸、又在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其初期阶段细胞膜的完整性就破坏了，故可以建立一种用 结合在细胞膜表面作为凋亡的指示剂并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。,技术支持
21、：免费电话：8008282330 8008571184,电子邮件：传真电话：86 512 68668874,联科生物技术有限公司,细胞凋亡分析-10-,凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料（如）有拒染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞 可被 着染而产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期 不会着染而没有红色荧光信号，正常活细胞与此相似。在流式细胞术双参数散点图上（见图-9），左下象限显示活细胞，为（）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（）；而右下象限为凋亡细胞，显现（）。图（一）有阴性细胞群体例如在进行射线、药物对细胞作用的研究时，实验方案中存在着
22、一群在正常环境中培养的细胞，这群细胞可以认为没有凋亡发生，其作为阴性对照进行试验。图 为研究不同的药品作用下细胞凋亡情况的变化。,技术支持：免费电话：8008282330 8008571184,图,电子邮件：传真电话：86 512 68668874,联科生物技术有限公司,细胞凋亡分析-11-,（二）无阴性细胞群体说明直接针对某一标本，要求测定其中凋亡细胞的比率。PI 检测：COULTER 使用第三荧光检测通道检测，BD 使用第二荧光通道检测。2染色（1）常规制备单细胞悬液，用冷 PBS 洗两次后（若为全血要先溶血）取约 5106 个细胞，1500rpm 离心，弃上清，用 400l 1Bindi
23、ng Buffer 重悬；（2）分成 a，b，c，d，e 五管，每管约 1106 个细胞；（3）a 管不加任何试剂，作为阴性对照管；（4）b 管加 2%的多聚甲醛中固定 30 分钟，用 Annexin V 和 PI 双染，作阳性对照；（5）c 管只加 10l PI 液，避光孵育 15 分钟；（6）d 管只加 5l Annexin-V 液，避光孵育 15 分钟；（7）e 管加 10l PI 液和 5l Annexin-V 液，室温避光孵育 15min；（8）每管各加 400l 1Binding Buffer 上机检测。3检测（1）检测阴性对照管（a），建立 Annexin V vs PI 双参数
24、点图，建立十字门 R1 确定阴性范围。调节电压将阴性细胞置于该区域。（2）上 d 管，通过调节补偿将 FITC 漏入 FL2（或 3）的荧光去掉（3）上 c 管，通过调节补偿将 PI 漏入 FL1 的荧光去掉（4）上阳性对照（b）将十字门位置上调，大致包含双阳性细胞的 90%（5）上检测管（e），并读数。方法更进一步改进，使用 进行凋亡检测，这使得可以同时使用使用 标记的抗体或绿色荧光蛋白（，）进行试验。或 可以检测死细胞。如图，用 检测 阳性和 阴性细胞的凋亡情况。,技术支持：免费电话：8008282330 8008571184,电子邮件：传真电话：86 512 68668874,联科生物技
25、术有限公司,细胞凋亡分析-12-,图,第四部分,细胞内组分改变,一、线粒体膜电位的改变在凋亡研究的早期，从形态学观测上线粒体没有明显的变化。随着凋亡机制的深入研究，发现线粒体凋亡也是细胞凋亡的重要组成部分，发生很多生理生化变化。例如，在受到凋亡诱导后线粒体转膜电位会发生变化，导致膜穿透性的改变。现认为，凋亡细胞 的降低可能与细胞内还原型谷胱甘肽（，）的减少有关，当 减少可致细胞内活性氧（）增加，包括超氧化阴离子（）,技术支持：免费电话：8008282330 8008571184,电子邮件：传真电话：86 512 68668874,联科生物技术有限公司,细胞凋亡分析-13-,和氧化型谷胱甘肽（）
26、增加。有些染料可检测线粒体膜电位（，）的变化。其中常用的阳离子绿色荧光染料罗丹明（，）可作为线粒体探针，其可在正常活细胞的线粒体内聚集，当细胞 降低，则减少，因线粒体膜的转运能力降低可使 降低和电负性降低，故细胞线粒体聚集 的能力丧失，使 荧光强度降低。但是，这种方法不能区分细胞凋亡或其他原因导致的线粒体膜电位的变化。二、深酶体质子泵的改变吖啶橙（）进行染色，这种染料在浓度较低（）时可对活细胞进行染色，其红色荧光的强度也是反映溶酶体质子泵（）功能的一重要参数。呈弱碱性，溶酶体内部的 值较低。未带电荷时可以透过细胞膜，进入溶酶体内。一旦 进入溶酶体，由于含有较高水平的质子而被质子化。因此，这一染
27、料就能包裹在这种小的细胞器中，积聚的程度在很大程度上决定了溶酶体跨膜 差。而 依赖性的质子泵是维持溶酶体 梯度的主要因素。发生早期凋亡的细胞，其溶酶体在结构上基本保持完整，没有发生改变，因而可使 染料进行累积，也就是说细胞凋亡的早期，依赖性的质子泵不会发生明显的改变。但随着凋亡的发生，细胞溶酶体的结构和功能可受到影响轻度的改变，其对 的摄取量减少。还有坏死细胞失去溶酶体完整结构，也失去了积累 染料的能力，因而其红色荧光很低。,第五部分,细胞 DNA 含量分布,细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生一系列特征性改变，包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等。年许多实
28、验室独立报道了，由于核的改变造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞的 可染性发生改变。细胞凋亡时，核酸内切酶激活，导致 广泛断裂，这是细胞凋亡的特征性表现，也为 鉴别细胞凋亡奠定了物质基础。目前检测凋亡细胞 断裂的方法中，最常用、最简便的就是 含量分析。细胞在染色之前，首先经去污剂处理，使细胞通透性增加，或者用沉淀固定剂进行固定。由于细胞膜的通透性增加和固定剂的影响，使降解的 不能完全封闭于细胞中，在细胞洗染过程中 碎片从细胞内逸出。因此，凋亡细胞 含量减少；加之由于 的降解，与荧光染料的结合减少，故细胞 荧光强度降低；直方图上显示在 峰前出现一个 含量减少的亚二倍体或称亚 峰，又称凋亡细胞峰（见图
29、-12）。,技术支持：免费电话：8008282330 8008571184,电子邮件：传真电话：86 512 68668874,联科生物技术有限公司,细胞凋亡分析-14-,图 12通过 测定 的含量，亦可同时分析凋亡细胞的周期位置，故 测定 含量可同时研究凋亡细胞的周期特异性。等用 研究细胞凋亡与细胞周期的关系后提出凋亡分两个阶段：早期凋亡（）即发生于药物作用于特定的周期时相的细胞凋亡（）多在作用后 小时内。而延迟凋亡（）是指发生于同一周期的细胞凋亡（），或发生在分裂期后即子代细胞或称为分裂后细胞凋亡（）。他们指出：化疗药物对细胞作用是药物浓度和作用时间依赖性的，可分为四个阶段：（）亚细胞阻滞
30、阶段时 迅速修复，细胞存活，并具克隆性，随后可发生细胞分化，子代细胞的基因突变；（）损伤，干扰细胞周期阶段或者 损伤后再修复，可导致子代细胞的突变或发生延迟凋亡；（）药物浓度的进一步加大则可导致早期凋亡和延迟凋亡；（）更大剂量则造成细胞坏死。另外，应用 方法，通过对 和 的联合检测，可以鉴别出 期细胞。因此，可分析细胞凋亡与 或 期细胞的关系。对 含量的测定直观、简便、迅速、实用，是 判断细胞凋亡的基本方法。降解的程度取决于细胞凋亡的阶段、细胞的类型和凋亡诱发因素的特性。另外，染色过程中 逸出量的变化也影响 检测结果。据研究，将高浓度的磷酸枸橼酸缓冲液（，）较 平衡盐溶液（，）更易使凋亡小体析
31、出，即将 加入漂洗液中，可增高降解 的逸出量，使亚峰 峰更为清晰，从而提高 区别凋亡细胞与正常细胞的能力。含量测定在检测的细胞凋亡过程中的局限性在于其特异性不很高，因为：（）亚 峰的细胞数目只代表了核碎片的数目，并不代表凋亡细胞的细胞数目；（）亚 峰并非凋亡细胞所特有，非整倍体细胞、机械损伤细胞均可造成亚 峰。因此，含量检测方法进行凋亡细胞分析时应注意结合其它形态学、免疫学或生物学方法或死活细胞计数，标准二倍体、免疫标志等参数进行综合分析，以更为准确地分析凋亡细胞状态。【实例一】如图：胸腺细胞在加入了 的培养液中培养 小时，处理后经 染色：乙醇固定、处理、染色（线性 荧光）和直接 染色（对数
32、荧光），凋亡检测结果差别不很明显。,技术支持：免费电话：8008282330 8008571184,电子邮件：传真电话：86 512 68668874,联科生物技术有限公司,细胞凋亡分析-15-,图【实例二】小鼠 T 细胞经 DEX 诱导凋亡。在 DNA 直方图上，凋亡细胞产生一个宽的亚倍体峰，这群细胞表现更高的 SSC 信号（如图 14）。图,技术支持：免费电话：8008282330 8008571184,电子邮件：传真电话：86 512 68668874,联科生物技术有限公司,细胞凋亡分析-16-,【实例三】细胞在凋亡诱因连续作用进程中，直方图的连续变化（如图）图（一）方法一【试剂与仪器】
33、（）溶液；,技术支持：免费电话：8008282330 8008571184,电子邮件：传真电话：86 512 68668874,联科生物技术有限公司,细胞凋亡分析-17-,（）染液：将 溶于（）中，终浓度为，含。用棕色瓶 避光保存；（）乙醇；（）目筛网；（）流式细胞仪。【实验步骤】（）收集细胞，数目约（）个，离心，弃去培养液。（）洗涤 次。（）离心去，加入冰预冷的 的乙醇固定，小时。（）离心弃去固定液，重悬。（）目的筛网过滤 次，离心，弃去。（）用 染液染色，避光。（）流式细胞仪检测：用氩离子激发荧光，激光光波波长为，发射光波波长大于，产生红色荧光分析 荧光强度的直方图。（）结果判断：在分析
34、荧光的直方图时，先用门技术排除成双或聚集的细胞以及发微弱荧光的细胞碎片，在 荧光的直方图上，凋亡细胞在 期前出现一亚二倍体峰。如以 期所在位置的荧光强度为，则一个典型的凋亡细胞样本其亚二倍体峰的荧光强度为，可用鸡和鲑鱼的红细胞的 荧光强度做参照标准，两者分别为 和，可以确保在两者之间的不是细胞碎片而是完整的细胞。【注意事项】细胞凋亡时，其 可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一，但这种 可染性降低也可能是因为 含量的降低，或者是因为 结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致。在分析结果时应该注意。（二）方法二【试剂与仪器】（）多聚甲醛固定液：多聚甲醛；（）：在 中加入（胎牛血清）；（）染液：，
35、避光保存。【实验步骤】（）收集细胞，数目约（）个，离心，弃去培养液。（）洗 次。（）离心去，加入 和 的多聚甲醛固定液，轻轻混匀，在 下固定。（）离心弃去固定液，室温加入含 的，孵育。（）洗 次，每次。（）目筛网过滤 次。,技术支持：免费电话：8008282330 8008571184,电子邮件：传真电话：86 512 68668874,联科生物技术有限公司,细胞凋亡分析-18-,（）离心去，用 染液，避光至少。染色后 小时内均可进行流式细胞仪分析。（）流式细胞仪检测：同方法一。（）结果判断：同方法一，该法主要用于凋亡细胞的表型分析。,第六部分,原位标记技术 ISEL,原位标记（）是将渗入到凋
36、亡细胞中的外源性核苷酸在酶末端脱氧核苷酸转移酶（）和 聚合酶 或 大片段的催化下与凋亡细胞的单股或双股断链相结合，并能过一定的显示系统使之显示出来。通常有两种方法（如图 16），一是末端脱氧核苷酸转移酶介导的 缺口末端标记，简称；二是 聚合酶 或 大片段介导的原位缺口平移，简称。在不考虑所使用的催化酶时，统称为原位末端标记（）。这两种方法用于检测组织或培养细胞的凋亡，由于是检测细胞的核断裂片断所以可以检测早期的细胞凋亡，且特异性和敏感性都是较高的，就其敏感性而言，鉴定高于 鉴定。常用的标记物和显示系统有：生物素标记的，其相应的显示系统为卵白素或链卵白素标记的辣根过氧化物酶（）和显色底物；地高辛
37、标记的，显示系统为辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体（正常羊 的 片断）和；荧光素标记的（常用），用流式细胞仪分析或在荧光显微镜下观察。值得注意的是，就 技术本身而言，是不能区别凋亡、坏死和自溶性死亡，必须结合凋亡细胞的形态学特征加以判断。和 鉴定标记的阳性细胞可结合下列标准加以判断：单个或少数几个孤立地分布在组织中；具有凋亡细胞的核特征，即核固缩显一个或多个染色体团块，凋亡小体核片断；周围或局部无炎症反应的征象。图,技术支持：免费电话：8008282330 8008571184,电子邮件：传真电话：86 512 68668874,联科生物技术有限公司,细胞凋亡分析-19-,一、原位缺口末端标记
38、法 原位标记法是 年 等首先报道，它实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养细胞和从组织中分离的细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。该方法首先采用蛋白酶 消化法或渗透法对标本细胞进行打孔，后将标本与 和 及 标记的 一起温育，在温育过程中，将荧光素或生物素标记的 连接到 片断的自由 末端上，采用生物素标记时可在荧光显微镜下直接对荧光素标记的 片断进行观察；采用生物素标记
39、时，需以亲合素生物素辣根过氧化物酶或亲合素碱性磷酸酶系统显色后分析。亦可采用偶联于碱性磷酸酶分子的抗荧光素抗体或连接于过氧化物酶分子的抗荧光素抗体作为检测试剂。、过氧化酶标记普通光学显微镜检测【基本原理】Dig-11-dUTP 在酶的作用下，可以渗入到凋亡细胞双链或单链 DNA 的 3-OH 末端，并可与酶标的抗地高辛抗体结合。在适当底物存在下，产生颜色反应，特异准确地定位出正在凋亡的细胞。洋地黄植物是地高辛的唯一来源。在所有的动物组织中几乎不存在能与抗地高辛抗体结合的配体，因而非特异性反应很低。抗地高辛的特异性抗体与脊椎动物甾体激素的交叉反应不到 1%，若此抗体的 Fc 部分通过蛋白酶水解的
40、方法除去后，则可完全排除细胞 FC 受体非特异性的吸附作用。【检测方法】仪器染色缸、湿盒、恒温水浴箱、恒温箱、光学显微镜。试剂及配制1）磷酸盐缓冲液（PBS），pH7.4：磷酸钠盐（PBS）50mmol/L，NaCl 200mmol/L。2）蛋白酶 K（200g/ml）：蛋白酶 K 0.02g，PBS 100ml，pH7.4。3）含 2%过氧化氢的磷酸盐缓冲液：过氧化氢（30%）2.0ml，磷酸缓冲液 98.0ml，pH7.4。4）TdT 酶缓冲液（新鲜配制）：Trizma 碱 3.63g，用 0.1N HCl 调节 pH 至 7.2，加蒸馏水定容 1000 再加入二甲胂酸钠（CH3）2AsO
41、2Na.3H2O和氯化钴（CoCCl2.6H2O）。5）TdT 酶反应液（新鲜配制）：TdT 酶缓冲液 76l，TdT 酶，Dig-11-dUTP，混匀，置于冰上备用。6）洗涤与终止缓冲液：NaCl 17.4g，柠檬酸钠 8.82g，蒸馏水 1000ml。7）0.05%（W:V）二氧基联苯胺（DAB）溶液（新鲜配制）：DAB 5mg，PBS 5ml，ph7.4，临用前过滤，加 H2O2 至 0.02%（V:V）。8）0.5%（W:V）甲基绿：甲基绿 0.5g，0.1mmol/L 乙酸钠 100ml，pH4.0。9）100%丁醇，100%，95%，90%，80%，70%乙醇，二甲苯，10%中性甲
42、醛溶液，乙醇，松香水等。10）过氧化物标记的抗地高辛抗体（ONCOR）,技术支持：免费电话：8008282330 8008571184,电子邮件：传真电话：86 512 68668874,联科生物技术有限公司,细胞凋亡分析-20-,操作方法1）标本预处理石蜡包埋的组织切片预处理将组织切片置于染色缸中，用二甲苯洗两次，每次 5 分钟。用无水乙醇洗两次，每次 3 分钟。用 95%和 75%乙醇各洗一次，每次 3 分钟。用 PBS 洗 5 分钟加入蛋白酶 K 溶液（20l/ml），于室温水解 5 分钟，去除组织蛋白。用蒸馏水 4 洗次，每次 2 分钟，然后按下述步骤 2）进行操作。冰冻组织切片预处理
43、将冰冻组织切片置 10%中性甲醛中，于室温固定 10 分钟后，去除多余液体。用 PBS 洗两次，每次 5 分钟。置乙醇：乙酸（2:1）的溶液中，于-20处理 5 分钟，去除多余液体。用 PBS 洗两次，每次 5 分钟，然后按下述步 2）进行操作。培养的或从组织中分离的细胞预处理将约 5107 个细胞于 4%中性甲醛室温中固定 10 分钟。在载玻片上滴加 50-100l 细胞悬液并使之干燥。用 PBS 洗两次，每次 5 分钟，然后按下述步骤 2）进行操作。2）在染色缸中加入含 2%过氧化氢的 PBS，于室温反应 5 分钟。用 PBS 洗两次，每次 5分钟。3）用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余
44、液体，立即在切片上加 2 滴 TdT 酶缓冲液，置室温 15 分钟。4）用滤纸小心吸去切片周围的多余液体，立即在切片上滴加 54lTdT 酶反应液，置湿盒中于 37反应 1 小时（注意：阴性染色对照，加不含 TdT 酶的反应液）。5）将切片置于染色缸中，加入到已预热到 37的洗涤与终止反应缓冲液，于 37保温30 分钟，每 10 分钟将载玻片轻轻提起和放下一次，使液体轻微搅动。6）组织切片用 PBS 洗 3 次，每次 5 分钟，直接在切片上滴加过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，于湿盒中室温反应 30 分钟。7）用 PBS 洗次，每次 5 分钟。8）在组织切片上直接滴加新鲜配制的 0.05%DAB
45、溶液，室温显色 36 分钟。9）用蒸馏水洗 4 次，前 3 次每次 1 分钟，最后 1 次 5 钟。10）于室温用甲基绿进行复染 10 分钟。用蒸馏水洗 3 次，前两次将载玻片提起放下 10次，最后一次静置 30 秒钟。依同样方法再用 100%正丁醇洗 3 次。11）用二甲苯脱水 3 次，每次 2 分钟，封片、干燥后，在光学显微镜下观察并记录实验结果。【注意事项】一定要设立阳性和阴性细胞对照。阳性对照的切片可使用 DNase 部分降解的标本，阳性细胞对照可使用地塞米松（1mol/L）处理 34 小时的大、小鼠胸腺细胞或人外周血淋巴细胞，阴性对照不加 TdT 酶，其余步骤与实验组相同。2地高辛标
46、记 dUTP/荧光素标记抗地高辛抗体荧光显微镜检测,技术支持：免费电话：8008282330 8008571184,电子邮件：传真电话：86 512 68668874,.,联科生物技术有限公司,细胞凋亡分析-21-,【基本原理】Dig-11-dTUP 在 TdT 酶的作用下，可以掺入到凋亡细胞双链或单链 DNA 的 3-OH 末端，荧光素标记的抗地高辛抗体可与反应部位结合。当遇到波长为 494nm 的激发光时，荧光素产生波长为 525nm 的发射光，从而可在荧光显微镜下观察计数，或使用流式细胞仪进行定量测定。本法与细胞化学染色方法比较，具有可以测定早期凋亡细胞的特点，并且可测定在细胞周期中 D
47、NA 发生断裂的具体时相。本实验采用的 DNA 末端标记法要比 DNA 缺口翻译标记法灵敏 10 倍以上。本法具有很低的非特异染色，凋亡细胞产生的信号强度至少比非凋亡细胞高 38 倍以上，测定凋亡细胞的灵敏度要比测定坏死细胞高 10 倍以上。【检测方法】仪器离心机、染色缸、湿盒、恒温水浴、恒温箱、荧光显微镜等。试剂及配制1）磷酸缓冲液（PBS，pH7.4）：磷酸钠盐，50mmol/L，NaCl 200mmol/L。2）蛋白酶 K（200）：蛋白酶 K0.02g，PBS 100ml，pH7.4。3）含 1%多聚甲醛的 PBS，pH7.4。4）100%、95%、90%、80%和 70%乙醇，二甲苯
48、，中性甲醛，乙酸，RNA 酶。5）Trizma 酶缓冲液，pH7.2（新鲜配制）：Trizma 碱 3.63g，用 0.1N HCl 调节 pH 至 7.2，二甲胂酸钠（CH3）2AsO2Na 3H2O 29.96g，氯化钴（CoCCl2.6H2O）0.238g，加蒸馏水至 1000ml。6）TdT 酶反应液（新鲜配制）：酶缓冲液 76l，TdT 酶 32l，混匀，置于冰上备用。7）洗涤与终止反应缓冲液：NaCl 17.4g 柠檬酸钠 8.82g，蒸馏水 1000ml。8）荧光素（FITC）标记的抗地高辛抗体工作溶液：含 1%BSA 的 PBS 56l，荧光素标记的抗体（ONCOR）49l，混
49、匀，置冰上备用。9）含 0.1%Triton X-100 的 PBS：Triton X-100 1.3ml，PBS 128.7ml，pH7.4，混匀，4保存，可用一个月。10）PI 染色液（新鲜配制，冰上保存）：碘化丙啶（PI）50g，RNA 酶（5000 单位）0.5mg，PBS 10ml，pH7.4。操作方法（1）标本预处理1）石蜡包埋组织切片预处理：将组织切片置于染色缸中，用二甲苯洗两次，每次 5 分钟。用无水乙醇洗两次，每次 3 分钟。用 95%各 75%乙醇各洗一次，每次 3 分钟。用 PBS 洗 5 分钟。加入蛋白酶 K 溶液（20），于室温水解 15 分钟，去除组织蛋白。用蒸馏水
50、洗 4 次，每次 2 分钟，然后按下述步骤（2）进行操作。2）冰冻组织切片预处理：将冰冻组织切片置 10%中性甲醛中，于室温固定 10 分钟后，去除多余液体。用 PBS 洗两次，每次 5 分钟。置乙醇：乙酸（2：1）的溶液中，于-20处理 分钟去除多余液体。用 PBS 洗两次，每次 5 分钟，然后按下述步骤（2）进行操作。3）培养或从组织分离的细胞的预处理：将 5107 个细胞/ml 于 4%中性甲醛室温中固定10 分钟。,技术支持：免费电话：8008282330 8008571184,电子邮件：传真电话：86 512 68668874,联科生物技术有限公司,细胞凋亡分析-22-,在玻片上滴加
