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1、,电 泳 技 术,琼脂糖凝胶电泳技术,实验室常用琼脂糖有常熔点和低熔点两种类型。低熔点(LMP)可用于DNA片段的回收。由于其凝胶中无抑制酶，可在凝胶中进行酶切、连接。,DNA电泳影响因素,1 DNA分子大小2 DNA分子构型 一般，质粒DNA分子超螺旋的最快、线状分子次之、开环分子最慢。3 凝胶浓度 对于 小片段DNA分子的分离采用高浓度的凝胶分离，对于大片段则用低浓度的凝胶。,DNA电泳影响因素,4 电场强度 电场强度高，电泳速度快，但分辨率低。5 EB6 电场缓冲液 TAE Tris-乙酸 TBE Tris-硼酸 TPE Tris-磷酸,50TAE Buffer 配制方法,1.称量Tri
2、s 242g，Na2EDTA.2H2O 37.2g 于1L烧杯中；2.向烧杯中加入约800ml去离子水，充分搅拌均匀；3.加入57.1ml的冰乙酸，充分溶解；4.加去离子水定容至1L后，室温保存。,10TBE Buffer配制方法,1.称量Tris 108g，Na2EDTA.2H2O 7.44g，硼酸55g 于1L烧杯中；2.加入约800ml去离子水，搅拌均匀；3.加去离子水定容至1L，室温保存。,电泳示意图,仪器和试剂,仪器电泳仪电泳槽灌胶模具等,1 电泳缓冲液2 上样缓冲液,常用电泳缓冲液,作用：增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。使
3、样品呈色，使加样操作更方便。,上样缓冲液,溴酚兰缓冲液 100ml 溴酚兰 0.25g 二甲苯青 0.25g 蔗糖 40g,上样缓冲液(1),6上样缓冲液 loading buffer 100ml30mM EDTA36%(V/V)丙三醇0.05%(W/V)溴酚蓝PH7.0,上样缓冲液(2),溴化乙锭（EB）是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。1 称取1gEB固体于专用容器中；2 加入100ml的ddH2O，搅拌至溶解完；3 转移至棕色瓶中，4避光保存。注意事项：EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。,核酸染色剂,DNA分子量标准,操作步骤：
4、,1 凝胶制备 制备0.8%琼脂糖凝胶 称取适量琼脂糖加入 20mL 0.5TBE，加热至琼脂糖全部熔化，冷却至50-60 时，加入 EB 溶液。缓慢倒入胶板，待胶凝固后拔出梳子。,2 加样 取10l DNA样液与 2l 上样 buffer 混匀，用微量移液器小心加入样品槽。,3 电泳 接通电源，切记靠近加样孔的一端为负，电压为15V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）,待溴酚兰移动到一定位置，停止电泳。,观察拍照,聚丙烯酰胺凝胶电泳,45%的聚丙烯酰胺1000ml 丙烯酰胺 434g 甲叉双丙烯酰胺 16g 加600mlddH2O在37溶解，最后定容到1000ml.,9%的聚丙烯酰胺凝胶1
5、50ml 45%的聚丙烯酰胺 30ml 20TBE 7.5ml ddH2O 48ml 尿素 63g 以上在37溶解，然后预冷到4，再加入1.6%AP(过硫酸铵)5ml和TEMED(四甲基乙二胺)75ul。,0.2%的银染液500ml 取硝酸银1.0g加超纯水充分溶解，然后定容到500ml,避光、低温保存备用。显影液400ml NaOH 2g 四硼酸钠 0.08g 甲醛 1.6ml,聚丙烯酰胺电泳基本步骤：,(1)首先用自来水沾上洗涤剂把两块玻璃板擦洗干净，然后用蒸馏水冲洗，干燥后用无水乙醇仔细擦洗一遍，待酒精完全挥发后就可以制胶板。,聚丙烯酰胺电泳基本步骤：,(2)将两块玻璃板固定在电泳槽中，
6、通过调整旁边的螺母使玻璃板受力均匀，向电泳槽中倒入少量的缓冲液检查是否漏液。,(3)取50ml的9%变性聚丙烯酰胺胶液，用针筒将胶液缓缓注入两个玻璃板的夹层中，然后从灌胶口将梳子轻轻插入到合适位置，用吹风机吹热风以加速其凝固，在其凝固过程中，注意补充胶液。,(4)将电泳槽装配好后，向槽中灌0.5XTBE，用吸水纸将电极擦干，以防止电泳时短路，恒电压350V预电泳30min.,(5)将梳子小心拔出后就可以点样，每孔点样15L。恒电压450V电泳34h至二甲苯青为胶板的2/3处，在电泳过程中要确保胶板温度不高于50以免玻璃板破裂。,(6)电泳结束后，先将缓冲液倒出，再将玻璃板从电泳槽取下。然后小心地将胶板移入去离子水中，轻摇漂洗两次，每次1min。,(7)倒入0.2%的AgNO3进行银染15min，然后用去离子水轻摇漂洗两次，每次1min。(8)用显影液处理20min,然后用去离子水轻摇漂洗两次，每次1min。(9)将胶板放在观灯机上用数码相机照相保存，进行数据分析与处理。,思考题：1 琼脂糖凝胶电泳基本过程 2 聚丙烯酰胺凝胶电泳基本过程,
